硝酸イオンバイオセンサーの開発と水界中窒素除去技術の確立

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11794014
• 研究機関: 京都府立大学
• 研究代表者: 竹葉 剛 京都府立大学, 人間環境学部, 教授 (10046500)
• 研究分担者: 山下 博史 京都府立大学, 人間環境学部, 助手 (50264750) ; 白石 斉聖 神戸大学, 農学部, 助手 (00304121) ; 椎名 隆 京都府立大学, 人間環境学部, 助教授 (10206039) ; 森 真理 滋賀県農業試験場, 主任研究員(研究職) ; 中村 考志 京都府立大学, 人間環境学部, 助手 (90285247)
• キーワード: 硝酸イオン / バイオセンサー / アンモニア / グルタミン合成酵素 / 富栄養化 / 脱窒作用 / 硝酸還元酵素 / イネ

研究概要

わが国の河川・湖沼及び地下水中の硝酸性窒素が次第に増加してきており、国民の健康上大きな問題となっている。
この問題を解決するために、1)硝酸イオンバイオセンサーをつくり、誰もが簡便に精度よく水界中の硝酸塩濃度を測定できるようにする、2)植物の窒素吸収過程の鍵酵素の一つであるグルタミン合成酵素について、高い酵素活性を持つ植物を調べその遺伝子を単離し、形質転換により高い窒素吸収能をもつ植物をつくる、3)ヨシ群落の脱窒作用を実測し、水質浄化の方策を立てる、ことの3つの目的で研究を開始した。今年度の研究成果は次の通りである。
1)ホウレンソウの硝酸還元酵素(Nitrate Reductase,NR)cDNAを酵母(Pichia pastoris)に遺伝子導入して、NRタンパク質の発現に成功した。このNRタンパク質を用いて簡易型センサーを試作した。
2)グルタミン合成酵素を高発現するイネ、ヨシを作るため、イネGS2cDNAをアグロバクテリア法で遺伝子導入し、形質顕官イネ、ヨシをそれぞれ20数固体作製した。形質転換ヨシについて、GS2発現量をウェスタン分析で確認後、アンモニア吸収能を測定したところ、対照区に対してアンモニア吸収能が上昇していることを確認した。
3)GS2遺伝子を葉緑体ゲノムに導入した。ノザーン分析では大量に発現していることを確認したが、GS2タンパク質の蓄積はごくわずかであった。その原因について検討すると共に、別のベクターを構築して再度葉緑体形質転換を試みている。
4)脱窒作用を測定するためのイネの実験系を作製し、15Nを用いるトレーサー実験を行った。現在15Nの検出感度を上げるための工夫を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Toyama, T, et. al.: "A cytokinin-repressed gene in cucumber for a bHLH protein homologue is regulated by light"Plant Cell Physiol.. 40・10. 1087-1092 (1999)
• [文献書誌] Satoh, J., et al.: "Developmental stage-specific multi-subunit plastid RNA polymerases(PEP)in wheat"Plant J. 18. 407-416 (1999)
• [文献書誌] Morikawa, K, et al.: "Circadian-regulated expressionof a nuclear-encoded plastid sigma factor gene(sigA)in wheat seedlings"FEBS Lett.. 451. 275-278 (1999)
• [文献書誌] Shiina, T., et. al.: "Chloroplast tubules visualized in transplastomic plants expressing green fluorescent protein"Plant Cell Physiol.. 41. 275-278 (2000)
• [文献書誌] Nakazawa, A.et al.: "Expression pattern and gene structure of phenylalanine ammonia-lyase in Pharbitis nil"J.Plant Res.. 114. 323-328 (2001)
• [文献書誌] Ogihara, Y.et.al.: "Chinese Spring wheat(Triticum aestivum L.)chloroplast genome: complete sequence and contig clones"Chinese Spring wheat(Triticum aestivum L.)chloroplast genome: complete sequence and contig clones. 60(6-66) (2000)