臍帯血幹細胞のex vivo増幅デバイスの開発とその臨床応用

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11794036
• 研究機関: 東海大学
• 研究代表者: 堀田 知光 東海大学, 医学部, 教授 (70173606)
• 研究分担者: 辻 孝 日本たばこ産業, 医薬探索研究所, 主任研究員 (50339131) ; 加藤 俊一 東海大学, 医学部, 助教授 (70096212) ; 安藤 潔 東海大学, 医学部, 講師 (70176014)
• キーワード: 臍帯血、 / 造血幹細胞、 / 体外増幅、 / 造血幹細胞移植、 / マウス骨髄ストローマ細胞株 / 膜分離型共培養系、 / サイトカイン

研究概要

臍帯血は造血幹細胞胞移植に際し骨髄、末梢血に次ぐ第3の造血幹細胞供給源として近年注目を集めている。特に平成11年に発生した東海村における放射線被曝事故のような災害時には直ちに利用できる造血幹細胞供給源となる。しかし、膀帯血の最大の問題点は含有造血幹細胞数が限られており成人への適応が一部に限られていることである。申請者らは研究分担者である辻らが樹立したマウス骨髄ストローマ細胞株をfeeder layerとしたユニークな膜分離型共培養系を開発した。この培養系を利用して短期間に効率的な前駆細胞のex vivo増幅を可能にしたが応用する際の問題点として、(1)異種細胞に由来する微生物、異種蛋白などの混入の可能性、(2)培養系のスケールアップ化、(3)培養造血細胞の生着と造血維持の評価が重要となる。昨年度は(1)をほぼ解決したので本年度は(2)を可能とする装置を開発し、(3)を定量的SRCアッセイを用いて評価した。
1 増幅デバイスの開発
臨床応用に際しては50〜100倍のスケールアップが必要である。しかし、底面積が1cm^2以上のculture insertでは培養細胞が対流によってメンブレンの中央に集中して培養効率が低下する。従って単にculture insertのザイズを拡大するだけでは有効な増幅は得られない。そこで100cm^2のメンブレンを格子で仕切って各wellが1cm^2になる培養バッグを試作した。現在試作された培養バッグにより増幅された細胞のコロニーアッセイ、表面マーカー解析を施行中である。
2 増幅臍帯血の定量的SRCアッセイ
NOD/SCIDマウスを用いて増幅前後の臍帯血CD34細胞のSRC頻度を測定した。増幅前後でCD34細胞当たりのSRC頻度がほとんど同じであったため、SRCは10倍前後増幅されていることが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] Nakamura Y,Hotta T, et al.: "Ex vivo generation of CD34 positive cells from CD34 negative hematopoietic cells SRC derived from CD34(-)Lin(-)cells."Blood. 94. 4053-4059 (1999)
• [文献書誌] Ando K,Hotta T, et al.: "Extensive generation of human CD34+ hematopoietic stem cells from CD34(-)Lin(-)cells in vitro."Experimental Hematology. 28. 690-699 (2000)
• [文献書誌] Nakamura Y,Hotta T, et al.: "Effective enrichment of the precursor populations of human CD34+ hematopoietic cells by newly developed filter system."British Jornal of Hematology. 108. 801-804 (2000)
• [文献書誌] Shimakura Y,Hotta Y, et al.: "Murine stromal cell line HESS-5 maintains reconstituting ability of ex vivo-generated hematopoietic stem cells from human bone marrow and cytokine-mobilized peripheral blood."Stem cells. 18. 183-189 (2000)
• [文献書誌] Hagihara M,Ando K, et al.: "The efficient generation of CD83 positive immunocompetent dendritic cells from CD14 positive acute myelomonocytic or monocytic leukemia cells in vitro. "Leukemia Research. (in press). (2001)
• [文献書誌] Yin Y,Hagihara M,Ando K, et al.: "Enhancement of human cord blood CD34+ cell-derived natural killer cell cvtotoxicity by dendric cells."Jornal of Immunology. (in press). (2001)