遺伝子発現誘導システムを用いた癌抑制遺伝子の変異と抗癌剤感受性に関する研究

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11877251
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 戸口田 淳也 京都大学, 再生医科学研究所, 助教授 (40273502)
• 研究分担者: 中村 孝志 京都大学, 大学院・医学研究科, 教授 (10201675)
• キーワード: 骨肉腫 / 癌抑制遺伝子 / 抗癌剤 / 薬剤感受性

研究概要

癌抑制遺伝子の機能は。細胞周期の制御、アポトーシスの誘導、DNA修復機構への関与など、抗癌剤の作用機序と密接に関連している。本研究では、抗癌剤に対する感受性と代表的な癌抑制遺伝子であるRb遺伝子とp53遺伝子の変異の有無との関連性を解析するシステムの構築を、骨肉腫をモデルとして目指した。
1.癌抑制遺伝子欠損骨芽細胞系の樹立:p53(-/-)骨芽細胞は、既に我々が樹立したp53ノックアウトマウス由来の骨芽細胞系であるMMC2を用いた。Rb(-/-)骨芽細胞はRb(-/-)ES細胞を用いてキメラマウスを作成し、そのマウスより骨芽細胞を単離し、耐性マーカーを用いて、Rb(-/-)細胞を選択的に増殖させ、分化形質を指標としてRb(-/-)骨芽細胞を得た。
2.発現誘導ベクターの再構築:オリジナルの発現誘導システムは、テトラサイクリン・トランスアクチベーター(tTA)の発現ベクターにはHygromycinが、tTAにより発現が誘導される標的遺伝子発現ベク夕一にはNeomycinの耐性遺伝子が組み込まれているが、上記の細胞には、既にこれらの耐性遺伝子がゲノムに組み込まれているため、ベクターの再構築を行った。tTA発現ベクターに関しては、Puromycinを、標的遺伝子発現ベクターは、Blasticidinを組み込んだものを作成した。標的遺伝子としては、正常ヒトp53及びRb遺伝子をそれぞれ組み込んだものを作成した。
3.細胞への導入:Rb(-/-)骨芽細胞のtTA発現ベクターを導入し、15個のクローンを単離し、βガラクトシダーゼ遺伝子を用いた一過性の発現誘導能を解析したが、テトラサイクリン添加の有無による発現誘導効果が認められたクローンは得られなかった。現在更に、遺伝子導入効率の改善等の工夫を用いて解析を続けている。

研究成果

• [文献書誌] Kanoe,H.,et al.: "Characteristics of genomic breakpoints in TLS-CHOP translocations in liposarcomas suggest the involvement of Translin and topoisomerage II in the process of translocation"Oncogene. 18. 721-729 (1999)
• [文献書誌] Nakamura,I.,et al.: "Association of the human NPPS gene with ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine (OPLL)"Hum.Genet.. 104. 492-497 (1999)
• [文献書誌] Yamamoto,H.,et al.: "High incidence of SV40-like soquerces detection in tumor and peripheral blood cells of Japanese osteosorcoma potients"Br.J.Cancer. (in press).
• [文献書誌] Ito,H.,et al.: "Bone maphogenetic protein-6 and parathyroid hormone-related protein coordinately regulate the hypertrophic conversion in mouse cloral chondrogenic EC cells ATDC5"Biochim.Biophys.Acta. 1451. 463-470 (1999)
• [文献書誌] Ito,H.,et al.: "Hedgehog signaling molecules in bone marrow cells of the initial stage of fracture repair"Biochim.Biophys.Res.Commun. 262. 443-451 (1999)