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本年度も引き続き、植物ウイルスの複製に関与する宿主因子およびウイルス複製を阻害する因子を網羅的に特定するためのハイスループットな系の確立に先立ち、感染効率の高い植物ウイルスベクターの構築および最適化を行った。現在、植物ウイルスベクターとしてはpotato virus X (PVX)を利用したものが広く用いられている。しかし、PVXベクターは挿入配列の安定性に問題があり、さらにシロイヌナズナには感染できず、本研究に適さない。そこで、PVXに近縁でシロイヌナズナに感染するplantago asiatica mosaic virus (P1AMV)を利用し、ウイルスベクターを開発することとした。ウイルス複製の指標とするために、GFP遺伝子をP1AMVゲノムへと挿入した。まずはPVXベクターと同様の構築法を試したが、植物への接種の結果、ベクターからGFP遺伝子の脱落が確認された。そこで、口蹄疫ウイルスが持つ自己切断配列である2A配列を挟んで、GFPと外被タンパク質を融合タンパク質として翻訳させるなどの改変を施した。その結果、植物で安定的に目的タンパク質を発現させることができた。続いて、P1AWベクターを用いてシロイヌナズナへの接種を行ったところ、ウイルスのGFP蛍光の全身拡大が確認された。次に、このベクターをシロイヌナズナのプロトプラストへと接種したところ、ウイルスのGFP蛍光が観察できた。構築したGFP挿入P1AMV「ベクターを用いることで、植物ウイルスの複製に関与する宿主因子およびウイルス複製を阻害する因子を網羅的に特定するためのハイスループットな系を確立することが可能となった。従って、本研究の成果は、植物ウイルスの複製機構の全容解明につながる有用な知見となったと考えられる。
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