| 研究課題/領域番号 |
11J03948
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
栂 達也 大阪大学, 基礎工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| キーワード | ヌクレオチド除去修復 / 色素性乾皮症 / 紫外線DNA損傷 |
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| 研究概要 |
本研究はヒトのヌクレオチド除去修復機構(NER)を、蛍光を利用し検出する分子センサーの創製を目的としている。NERは紫外線により生じる「紫外線DNA損傷」などの比較的構造変化の大きいDNA損傷を修復する役割を担っている。このNERが欠損した遺伝性疾患として色素性乾皮症(XP)が知られており、日光を浴びると高頻度に皮膚がんを発症するといった病態を呈する。従ってXP患者を早期に発見し、紫外線への曝露を防ぐことは大変重要である。本分子センサーは、XP診断への応用が可能であると考えられるため、XP患者早期発見への貢献が期待される。
センサーは紫外線損傷を中央に含む2本鎖DNAに蛍光分子と消光分子を取り付けたもので、NERが起こると蛍光分子を含む鎖が解離して蛍光が発せられる。その際色素の導入位置と、NERによる切り込み位置の関係が検出には重要である。なぜならこの間の距離が長すぎると鎖がうまく解離しないためである。従って蛍光及び消光分子を含まない基質について、NERが起こる最短鎖長を以下に示す方法で決定した。
紫外線損傷にはNERの代表的な基質である(6-4)光産物を選び、これを含む長鎖DNAを合成した。このとき長さの異なるものを用意することで、鎖長を変化させた。その後HeLa全細胞抽出液と反応させ、ゲル電気泳動により解析するという手法により反応解析を行った。その結果、損傷の5'側については損傷から69塩基対が最低でも必要であることが示されたが、3'側についてはうまくNERが観察されなかった。
これについては新たな細胞抽出液を得て、現在実験中である。
またこれに関連して、生細胞への蛍光分子センサーの導入確認法を、蛍光色素リンカー部のリン酸ジエステル結合が細胞内で加水分解されることを利用して確立した。これは実際にセンサーをXP診断に応用していく際に、実用上で大変意義深い成果であるといえる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の予定としては、基質の最短鎖長等の条件の最適化を本年度中に終える予定であった。しかし年度途上に細胞抽出液の活性が失われて以降、活性を有する細胞抽出液を得られなかったためにこれを終えることができていない。よってこのような自己評価とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在の研究推進を妨げる問題点として、細胞抽出液が十分なNER活性を有していないということが挙げられる。これに関しては共同研究者の下で新たな細胞抽出液を得たため、これを用いて研究を推進していく予定である。またその際に得たノウハウに従い、細胞抽出液を自身の研究室で調製する方法を確立していきたいと考えている。それにより安定した細胞抽出液の供給が可能になり、より条件検討などの実験を盛んに行うことができるようになると期待される。基質の最適化が終われば、その知見に基づきセンサーの合成およびその評価を行っていく予定である。
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