研究課題
3年間の目標は、幹細胞独特な遺伝子発現抑制系と、この系が関与している遺伝子群の網羅的解析にある。2年目として、初年度の研究成果を発展させた。Plzfと相互作用するタンパク質群をプロテオーム解析により明らかにするための足掛かりとして、SBP(ストレプトアビジン結合タンパク)タグ付きのPlzfをGS細胞に導入するためのレンチウイルスベクターを作製した。抗タグ抗体を利用した免疫沈降法により、Plzfを含むタンパク複合体を精製するための実験系を構築した。加えて、Plzfのゲノム上における結合領域を明らかにするために行うクロマチン免疫沈降-シークエンスの準備として、抗Plzf抗体によるクロマチン免疫沈降法の条件検討を行い、少数の細胞からでも良好な沈降結果を得た。この系を利用して、Plzfの精原幹細胞におけるChIP-Seqを行う予定である。また、これまでの研究成果をより発展させるために、whole genomeにおけるDNAメチル化の状態を解析した。解析に必要な幹細胞集団、前駆細胞集団をセルソーターによりマウス精巣から取得し、それらの細胞の品質管理を行ったうえで、PBAT法と呼ばれる方法を用いて次世代シークエンサーによる解析に必要なライブラリ作成を行った。次世代シークエンサーによる網羅的解析により、幹細胞集団と前駆細胞集団のメチル化部位の違いが明らかとなった。この結果を上記のPlzfのクロマチンにおける結合部位とも照らし合わせ、その関連性を模索し、精原幹細胞分化の内因的制御の解明につなげたいと考えている。
3: やや遅れている
これまでの研究成果をもとに、それを発展させることができた。しかしながら進行度合いとしては、当初の目標よりはやや遅れ気味であるので、さらに努力を続けていきたい。
最終年度は、2年間で構築した実験系を用いて、核内のクロマチン高次構造から幹細胞の特徴を明らかにしていきたい。具体的には、Plzfを含むタンパク質複合体解析、Plzfのゲノム上結合部位の同定を行いたい。また、クロマチンの動きを明らかにする実験系として、3C-PCRを習得したいと考えている。
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