研究課題
本研究は、ボツリヌス毒素複合体が体内に侵入する際にどのような受容体に結合するかを解明し、その糖鎖との結合様式を原子レベルで明らかにすることを目的としている。培養上清や汚染食品中において、ボツリヌス毒素は5種類のタンパク質成分(ボツリヌス神経毒素;BoNT、非毒非血球凝集素;NTNHA、3種の血球凝集素;HA-70,HA-33,HA-17)から構成される複合体として存在する。経口摂取されたボツリヌス毒素複合体は、主にHA-33の働きで小腸上皮細胞表面の糖鎖に結合するが、その糖認識特性および詳細な結合機序については未解明である。ボツリヌスCおよびD型毒素複合体に関してはHA-33を介してシアル酸に結合することが報告されていたが、本年度は、HA-33の一次構造に変異をもつC型Yoichi株毒素複合体がガラクトースに結合する特異性をもつことを新たに見出した。このことから、ボツリヌス毒素複合体の糖認識特性は、少なくともHA-33の構造に依存して変化することが示唆された。したがって、糖認識特性の異なるHA-33の立体構造を解明し、糖鎖との結合部位を原子レベルで解明することは、ボツリヌス毒素の小腸上皮細胞受容体への結合機序を明らかにする上で大変重要である。そこで、C型菌Yoichi株HA-33/HA-17複合体を精製し、蒸気拡散法を用いて結晶化に取り組み、初期条件を確立することに成功した。さらに、小角X線散乱法によりC型菌Yoichi株HA-33/HA-17複合体の溶液構造解析を行った。そのほか、本年度では、毒素複合体が認識する受容体特定に先立ち、種々の界面活性剤を用いた小腸上皮細胞の受容体タンパク質の可溶化実験を行い、本法に適する界面活性剤としてデオキシコール酸ナトリウム(SDC)を決定した。
2: おおむね順調に進展している
本研究の目的であるボツリヌス毒素の体内侵入に関わる小腸上皮細胞への結合機序を解明するためには毒素の糖認識特性を明らかにすることが重要である。本年度、ボツリヌスC型毒素複合体の中にガラクトース認識特性をもつタイプの毒素複合体が存在することを明らかにし、糖認識部位を特定するための前段階として、HA-33/HA-17複合体の結晶作製に成功した。また、受容体解明のための細胞可溶化試験に適した界面活性剤を決定することができた。したがって、本研究は、おおむね順調に進展していると評価する。
免疫沈降法を利用した受容体解析に際しては、毒素を細胞に加えて受容体に結合させた後に、界面活性剤を用いて毒素-受容体の複合体を抽出することを試みるが、この場合、界面活性剤の添加により、毒素-受容体間の結合が破壊されて解離するおそれがある。そのため、細胞を可溶化した細胞溶解液を毒素複合体毒素抗体に添加し免疫沈降する方法や、クロスリンカー試薬を使用して、毒素-受容体を共有結合させてから可溶化し免疫沈降する方法についても検討する。また、ボツリヌス毒素複合体の認識する糖鎖解明へのアプローチとして、種々の糖・糖タンパク質存在下における血球凝集活性試験を行うことにより、毒素複合体が認識する糖鎖構造を解析することを試みる。結晶化に関しては、HA-33/HA-17複合体とその認識糖との共結晶を作製し、株式会社リガクとの共同研究でX線結晶構造解析を実施することを今後の推進方策とする。
すべて 2012 2011
すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (10件)
Biochemical and Biophysical Research Communications
巻: 419 ページ: 500-504
DOI:10.1016/j.bbrc.2012.02.045
Acta Crystallographica Section F : Structural Biology and Crystallization Communications
巻: 68 ページ: 227-230
DOI:10.1107/S174430911105603X
FEMS Immunology & Medical Microbiology
巻: 63 ページ: 35-43
DOI:10.1111/j.1574-695X.2011.00825.x
巻: 61 ページ: 323-331
DOI:10.1111/j.1574-695X.2011.00779.x
