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2012 年度 実績報告書

哺乳細胞内の機能的タンパク質複合体を対象としたin-cell NMR法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 11J11066
研究機関東京大学

研究代表者

久保 智史  東京大学, 大学院・薬学系研究科, 特別研究員(DC2)

キーワードIn-cell NMR / CLIP-170 / 微小管 / TCS
研究概要

本研究では昨年度までに、NMRサンプル管内に培地を潅流するバイオリアクターを開発し、細胞内に導入した安定同位体標識タンパク質の相互作用を観測するNMR法であるin-cell TCS実験によって、CG1の微小管結合界面上に存在する残基であるL77, I90, L92, V103, I117において、相互作用を反映する顕著なNMRシグナル強度減少を観測した。
本年度は、観測された相互作用が内在性微小管との特異的な相互作用に由来することを確かめるため、過剰量の非標識CG1を細胞内に導入することによるCG1-微小管間相互作用の阻害実験を行った。そこで、安定同位体標識CG1に加えその10倍量の非標識CG1を細胞内に導入して、in-cellNMR測定を行った。まず、10倍量の非標識CGl存在下において細胞内におけるCG1と微小管の相互作用が阻害されているかどうかを調べるため、本実験条件下における細胞内CG1の化学シフト値を調べた。その結果、10倍量の非標識CGIを導入することで、内在性微小管との特異的な相互作用を反映する化学シフト変化が抑制され、細胞内におけるCGI-微小管間相互作用が阻害されていることが示された。次に、10倍量の非標識CGI存在下において、HeLa細胞内における安定同位体標識CG1のin-cell TCS実験を行った。
その結果、CGIのL77, I90, L92, V103, I117におけるシグナル強度減少は顕著に減弱し、CG1全残基におけるシグナル強度減少率は0.5以下に抑制された。よって、in-cell TCS実験において観測されたシグナル強度減少は、細胞内における微小管との相互作用界面を反映しており、in-cell TCS法によって細胞内に導入したタンパク質と内在性タンパク質との相互作用を観測することに成功したと結論した。
TCS法は膜タンパク質などの巨大分子との相互作用解析に実績がある手法であるため、今後in_cell TCS法によって細胞内の膜タンパク質との相互作用を解析できると考える。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は、過剰量の非標識CG1を用いた阻害実験により、in-cell TCS実験によって観測された相互作用が細胞内におけるCG1と内在性微小管との相互作用を反映したものであることを示した。また、NMRサンプル管内に潅流する培地の溶存酸素量、炭酸水素ナトリウム量を最適化することにより、NMRサンプル管内の細胞の生存率を向上させることに成功した。

  • 研究成果

    (2件)

すべて 2013 2012

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] A Gel-Encapsulated Bioreactor System for NMR Studies of Protein-Protein Interactions in Living Mammalian Cells2013

    • 著者名/発表者名
      Satoshi Kubo, Noritaka Nishida, Yuko Udagawa, Osamu Takarada, Shinji Ogino, Ichio Shimada
    • 雑誌名

      Angewandte Chemie International Edition

      巻: 52 ページ: 1208-1211

    • DOI

      10.1002/anie.201207243

    • 査読あり
  • [学会発表] An NMR method to observe protein・protein interactions in living mammalian cells using the gel encapsulated bioreactor system2012

    • 著者名/発表者名
      久保 智史
    • 学会等名
      International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
    • 発表場所
      フランス・リヨン
    • 年月日
      2012-08-20

URL: 

公開日: 2014-07-16  

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