| 研究課題/領域番号 |
11J40009
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
丸山 如江 京都大学, 農学研究科, 特別研究員(RPD)
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| キーワード | スフィンゴモナス属細菌 / フラジェリン / ペプチドグリカン |
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| 研究概要 |
スフィンゴモナス属細菌A1株のフラジェリンホモログおよびFlgJ(ペプチドグリカン分解活性を持ち鞭毛基部体形成に必須)に焦点を当て、フラジェリンの細胞表層分泌機構を分子生物学と構造生物学の観点から解析し、以下の知見を得た。
(1)A1株の培養条件を検討することにより、運動性を発現するA1株(A1-M5)を育種した。3種類のフラジェリンホモログ(p5、p5'、p6)のうち、単離した鞭毛にはp5とp6が等量含まれていた。p5、p6の遺伝子破壊株A1Δp5、A1Δp6、A1Δp5/p6を育種したところ、A1Δp5において運動性の大幅な低下が見られ、A1Δp6とA1Δp5/p6では運動性が完全に消失した。A1Δp5の鞭毛画分からはA1-M5のそれと同レベルのp6が検出されたが、A1Δp6とA1Δp5/p6の鞭毛画分からはp5、p6のどちらも検出されなかった。また、FlgJ遺伝子破壊株A1ΔFlgJの鞭毛画分からはp5とp6は検出されなかった。これらの結果から、(1)p5とp6は鞭毛の基部体を通って細胞外に分泌されること、(2)p5の発現あるいは分泌にはp6が必要であること、(3)p6単独でも鞭毛を形成できるが運動性の発現には不十分であること、が示唆された。
(2)これまでに得られていたSPH1045C(A1株FlgJのC末端ドメイン)の結晶中では、SPH1045CのC末端領域が、隣接する分子の活性部位に結合し、酵素と基質との結合を阻害するため、酵素・基質の複合体構造の解明が困難であるという問題点があった。この問題を解決するために、SPH1045CのC末端アミノ酸5～8残基を欠損した4種の変異体を作製した。作製した変異体はいずれも野生型と同等の酵素活性を示した。SPH1045CΔC8の結晶を調製し、分解能2.3Aで結晶構造を決定した。本構造中では活性部位に隣接分子の結合は見られず、これまで揺らぎのために決定できなかった活性中心付近にあるループ領域の構造を決定することができた。本ループ中のアミノ酸残基Glu224をAlaに置換した変異体E224Aは活性が野生型に比べて1/100に低下することからGlu224が活性に重要であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初予定していなかった運動性株A1-M5を取得したことにより、作製した変異株におけるフラジェリンの分泌解析が容易になった。一方、FlgJの構造機能相関解析に関してに、変異体の構造解析により新たな知見を得ることができたものの、複合体構造データの取得には至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度作製したFlgJ変異体(SPH1045CΔC8)を用いて酵素・基質複合体構造の解明を目指す。また、p5、p6、および鞭毛基部体構成タンパク質の抗体を作製し、野生株および変異株の免疫染色を行う。
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