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2012 年度 実績報告書

多様な微小管制御の構造生物学的アプローチ

研究課題

研究課題/領域番号 11J40042
研究機関奈良先端科学技術大学院大学

研究代表者

三島 綾子 (前崎 綾子)  奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 特別研究員(RPD)

キーワード微小管制御蛋白質 / 複合体 / チューブリン / NMR / 動的構造解析
研究概要

(1)End-binding protein 1 (EB1)とチューブリンとの弱い相互作用における構造学的研究
EB1は、チューブリンのプラス端に結合し、チューブリンの伸長を促進する蛋白質である。NMRによる解析と共に、SPR等を用いて、EB1とチューブリンとの相互作用を調べた。まずEB1のCHドメインとC末端領域の解析から、CHドメインのチューブリン結合領域がEB1の末端のヘリックス領域と弱い相互作用をすることで、チューブリンとの相互作用を阻害していること明らかにした。また、チューブリンとCHドメインとの相互作用は、GMPCPP結合チューブリンよりも、GTPγSチューブリンの時に強くなった。これは、β-チューブリンがGTP結合にともない構造変化を起こし、それをCHドメインが認識することを示している。これらの結果を論文に投稿した。
(2)チューブリンの発現系の構築及び変異体作成
大腸菌で、安定なチューブリンの発現、精製を行う為に、重合を阻害する変異体の導入を行った。重合を阻害することにより、α,β-チューブリンダイマーの精製が可能となれば、EB1との相互作用解析、複合体での立体構造解析を試みる予定である。
(3)リン酸化Protein kinase B (PKB)の発現精製
昨年度習得したカイコを用いたタンパク質の発現・精製を用いて、PKBの精製を行った。発現系作成時、Dualベクターを用いることによって、同じベクター内に、活性化キナーゼであるPDK1を導入し、蛋白質の発現時にPKBの活性部位がリン酸化されるようにデザインした。このシステムを用いてPKBを高効率で調製することに成功した。
(4)この他、ヒトTTL1の立体構造解析、転写抑制共役因子SHARP/SMRT複合体の立体構造解析とその相互作用解析に向けた研究も行った。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

EB1とチューブリンとの相互作用に関する研究については、EB1の自己阻害やチューブリンの相互作用領域に関する論文をまとめることができた。大腸菌を用いたチューブリン発現系の確立については、現在、変異を導入することにより、重合を阻害するチューブリンの発現、精製に向けて研究を進めている。この発現系の確立に成功すれば、さらに詳しくEB1との相互作用を解析することができる。また、TTLについても一残基変異を導入することにより、劇的に安定性を向上することができており、次年度は立体構造解析を進めることができる。

今後の研究の推進方策

チューブリンについては、重合することが問題となり、相互作用蛋白質との詳細な相互作用解析や複合体での立体構造解析を進めることが難しくなっている。そこで、現在、重合を阻害するチューブリン蛋白質の発現系の確立を試みており、これに成功すれば、チューブリンと相互作用する蛋白質と複合体の立体構造解析や詳細な相互作用の解析を進めることができる。
TTLについては、蛋白質の安定性が低く、大腸菌での発現、精製が難しかったが、一残基変異を導入することにより、安定なタンパク質を精製することができるようになった。この蛋白質を用いて、NMRを用いた動的構造解析に向けた実験を行っていく。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2013 2012

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (4件)

  • [雑誌論文] Microtubule-binding sites of the CH domain of EBl and its autoinhibition revealed by NMR.2013

    • 著者名/発表者名
      Kanaba T, Maesaki R, Mori T, I to Y, Hakoshima T, Mishima M.
    • 雑誌名

      Biochim Biophys Acta.

      巻: 1834 ページ: 499-507

    • DOI

      10.1016/j.bbapap.2012.10.013

    • 査読あり
  • [学会発表] 溶液NMR法を用いたEB1の自己阻害及び活性化機構の構造研究2012

    • 著者名/発表者名
      金場哲平
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      福岡国際会議場マリンメッセ福岡
    • 年月日
      2012-12-11
  • [学会発表] NMRによるマルチドメインタンパク質Protein kinase C全長の構造解析2012

    • 著者名/発表者名
      秋吉克昂
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      福岡国際会議場マリンメッセ福岡
    • 年月日
      2012-12-11
  • [学会発表] NMRによるマルチドメインタンパク質PKCの構造解析2012

    • 著者名/発表者名
      秋吉克昂
    • 学会等名
      第51回NMR討論会
    • 発表場所
      ウインクあいち
    • 年月日
      2012-11-08
  • [学会発表] NMR法によるマルチドメインタンパク質Protein kinase C の構造解析に向けた種々の試み2012

    • 著者名/発表者名
      秋吉克昂
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場
    • 年月日
      2012-06-21

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公開日: 2014-07-16  

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