| 研究概要 |
平成12年度は酸素運搬機能をアロステリックに制御できる新規な金属蛋白質の設計・合成と新たな人工蛋白質設計の手法としてのモジュールライゲーション法の確立を試みた。酸素運搬機能をアロステリンクに制御できる新規な金属蛋白質としては,そのテンプレートとして典型的なヘム蛋白質で可逆的な酸素結合機能を有するミオグロビンを用い,アロステリックな因子としては応用範囲の広い金属イオンを想定し,その結合部位としてはカルシウム結合蛋白質であるトロポニンCの第3結合ループを用いた。このカルシウムループは12残基のアミノ酸残基からなり,この部分だけでカルシウムイオンを結合できうることが報告されている。このループを挿入するミオグロビンの位置としては,酸素結合部位に近く,その活性を制御できると想定され,また,比較的アミノ酸の変異に寛容なCDコーナーを選択した。その結果,このループをCDコーナーに挿入した変異ミオグロビンは天然型に近い構造安定安定性を示し,大きなヘム近傍の構造変化も観測されなかった。この変異ミオグロビンにカルシウムを添加すると,そのNMR,IRスペクトルの変化から,ループを挿入した遠位側のアミノ酸の位置に変化が誘起されることが明らかとなり,また,その変化は変異ミオグロビンでのみ観測されたことがら,この変異ミオグロビンはカルシウムを結合でき,その結合部位は挿入したループ付近であることが示唆できた。一方,このカルシウム結合による酸素結合能の変化としては,その解離速度が約2分の1に減少した。このことはカルシウム結合によるループ構造の安定化によって説明できた。一方,モジュールライゲーション法については,ミオグロビンのモジュールを用いた実験から,モジュール間によるペプチドライゲーションが可能なことを示すことができ,新規人工蛋白質合成のための有力な手段につながることが明らかとなった。
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