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種々の細胞において新しく生合成された酸性加水分解酵素は、N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ(GPT)の作用により、リソソーム輸送タグとなるマンノース6リン酸残基が付加される。そして、これがマンノース6リン酸結合タンパク質にトラップされ細胞内のリソソームに輸送される。この機構において、GPTの糖鎖に対する基質特異性は以前より生成物であるリソソームタンパク質の糖鎖構造解析の結果より推定されていた。しかし、それらはリソソームへ輸送中、或いはリソソーム内において糖鎖の修飾を既に受けている可能性があり、GPT本来の基質特異性とは異なっている可能性がある。そこで、我々は、精製したGPTと蛍光標識した各種糖鎖を用いてin vitroの系でGPTの基質特異性を検討した。
我々は、まずウシ膵臓ミクロソーム分画よりイオン交換、金属キレートおよびConAクロマトグラフィーなどによりGPTを精製した。これと2-アミノピリジル化した様々な高マンノース型糖鎖を基質として反応させ、得られた生成物を逆相および順相カラムで分離し、TOF-MS、弱酸加水分解、グリコシダーゼ消化などにより生成物の構造を推定した。
その結果、高マンノース型糖鎖の1-6鎖非還元末端に位置するマンノース残基に最も良くN-アセチルグルコサミン-1-リン酸が付加され、次に1-3鎖の非還元末端から一つ内側のマンノース残基に良く付加されることが判明した。また、グルコースが一残基ついた付いたGlcMan9GlcNAc2にもGPTが反応し、2カ所のN-アセチルグルコサミン-1-リン酸付加サイトの存在が判明した。
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