| 研究概要 |
(1)Aspergillus fumigatus黒色胞子色素生合成に関与するポリケタイド合成酵素
A.fumigatus由來alb1遺伝子の全長ORFを異種糸状菌発現用プラスミドベクターのα-アミラーゼプロモーター下流に組み込み、A.oryzaeに形質転換・導入した。形質転換株の発現誘導菌体より、生産化合物を抽出、単離精製、各種スペクトルによる構造解析を行ったところ、A.nidulans由来のポリケタイド合成酵素WAの産物と全く同一のナフトピロンであった。一方、A.fumigatusゲノム上alb1遺伝子の近傍に存在するayg1遺伝子の破壊株を作製したところ、その胞子は、本来の黒色ではなくA.nidulansに類似した緑色を呈した。これらの結果から、Alb1pとAyg1pの両タンパクが本来の黒色色素生合成に関与するものと想定し、上記と同様の方法でalb1とayg1両遺伝子をA.oryzaeで共発現させた。その生産化合物を単離構造解析したところ、他の糸状菌における黒色メラニンの生合成中間体として確立されている1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンと同定した。以上の結果から、Aspergillusfumigatusにおいては、単独ではヘプタケタイド合成酵素として機能するAlb1pがAyg1pと協同することにより、ペンタケタイドである1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンを与え、これがA.fumigatus胞子のDHN-メラニン黒色色素の中間体となっていると結論した。
(2)Alternaria solani由来還元型ポリケタイド合成酵素遺伝子のクローニング
糸状菌還元型ポリケタイド合成酵素遺伝子として既にクローニングされているロバスタチンおよびT-トキシン生合成のPKSの配列をもとに、縮重入りプライマーをデザインし、ソラナピロン生産株A.solani548のゲノムDNAを鋳型にPCRを行い、約900bpの断片を得た。その配列は既知の還元型PKSと高い相同性を示したことから、A.solaniのゲノムDNAコスミドライブラリーを構築し、このPCR断片をプローブとしてスクリーニングを行い、陽性クローンを取得した。
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