天然物基本骨格合成酵素の構造と機能解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12045213
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 海老塚 豊 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (90107384)
• 研究分担者: 藤井 勲 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助教授 (70181302)
• キーワード: 生合成酵素 / ポリケタイド / 糸状菌 / カルコン / スチルベン / トリテルペン / オキシドスクワレン / サポニン

研究概要

前年度に引き続き、主に微生物由来各種ポリケタイド合成酵素(PKS)および高等植物由来オキシドスクワレン閉環酵素(OSC)の構造と機能解析を試みた。
(1)ソラナピロン生産菌Alternaria solaniより、新規デカケタイドalternapyrone合成酵素PKSNに加え、新たに2つの還元型-PKS遺伝子を取得した。全長塩基配列をgenome walkingにより決定し、異種糸状菌発現系により機能同定を急いでいる。
(2)トポピロン類を生産する糸状菌Phoma sp.より新規芳香族-PKS遺伝子のクローニングを試み、3種の遺伝子断片を得た。genome walkingによりコード領域の全塩基配列を決定した。その内の一種phomaCを、異種糸状菌あるいは酵母で発現し生成物を分析したところ、ノナケタイドであるトポピロン類の生産を確認した。現在酵素機能の詳細を解析中であるが芳香族-PKS反応における鎖長制御機構を探る上で格好の材料が得られたことになる。
(3)抗菌物質ジアセチルフロログルシン生産菌Pseudomanas fluorescensは、土壊改良バクテリアとして注目されている。すでにその生合成遺伝子クラスターがクローニングされており、その中のType-IIIポリケイタイド合成酵素は、テトラケタイドであるフロロアセトフェノン合成酵素と推定されていた。同菌株よりPCRにより同酵素遺伝子をクローニング、大腸菌で過剰発現、in vitroの反応を解析し、本酵素が、マロニル-CoA3分子を基質とし無置換のフロログルシンを生成することを発見した。無置換フロログルシンが直接のポリケタイド合成酵素の産物と認識されたことはなく、本発見によりフロログルシンは最も単純な芳香族天然ポリケタイドであることが明らかになった。現在、本酵素の大量発現、精製、結晶化を試みている。
(4)全ゲノム配列解析からArabidopsis thalianaのゲノム上には13種のOSC相同遺伝子の存在が明らかになっている。機能未同定の5クローンを取得し酵母での発現からそれらの生成物特異性を明らかにした。残りのクローンについてもクローニング、機能解析を進めている。

研究成果

• [文献書誌] Nobutaka Funa, Yasuo Ohnishi, Yutaka Ebizuka, Sueharu Horinouchi: "Properties and Substrate Specificity of RppA, a Chalcone Synthase Related Polyketid Synthase in Streptomyces griseus"J.Biol.Chem.. 277. 4628-4635 (2002)
• [文献書誌] Noriaki Kawano, Koji Ichinose, Yutaka Ebizuka: "Molecular Cloning and Functional Expression of cDNAs Encoding Oxidosqualene Cyclase from Costus speciosus"Biol.Pharm.Bull.. 25. 477-482 (2002)
• [文献書誌] Masaaki Shibuya, Mizue Nishioka, Uahio Sankawa, Yutaka Ebizuka: "Incorporation of Three Deuterium Atoms Excludes Intermediacy of Stilbenecarboxylic Aci in Stilbene Synthase Reaction"Tetrahedron.Lett.. 43. 5071-5074 (2002)
• [文献書誌] Jin-young Chung, Isao Fujii, Shigeharu Harada, Ushio Sankawa, Yutaka Ebizuka.: "Expression, Purification and Characterization of AknX Anthrone Oxygenase Involved Aklavinone Biosynthesis in Streptomyces galilaeus"J.Bacteriology. 184. 6115-6122 (2002)
• [文献書誌] Nobutaka Funa, Yasuo Ohnishi, Yutaka Ebizuka, Sueharu Horinouchi.: "Alteration of Reaction and Substrate Specificity of Bacterial Type III Polyketide Synthase by Site-Directed Mutagenesis"Biochem.J.. 367. 781-789 (2002)
• [文献書誌] Hong Zhang, Masaaki Shibuya, Yutaka Ebizuka, Shinso Yokota.: "Oxidosqualene Cyclases from Cell Suspension Cultures of Betula platyphylla var. japonica : Molecular Evolution of Oxidosqualene Cyclases in Higher Plants"Biol.Pharm.Bull.. (印刷中). (2003)
• [文献書誌] Isao Fujii, Akira Watanabe, Yutaka Ebizuka.: "The Aspergillus nidulans Polyketide Synthase WA.In "Handbook of Industrial Mycology""Marcel Dekker Inc.(印刷中). (2003)