骨髄細胞を用いた心不全の細胞移殖治療

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12136205
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 福田 恵一 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (20199227)
• 研究分担者: 伯野 大彦 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (80286476) ; 佐藤 敏彦 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (40286464) ; 高橋 栄一 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (00276247) ; 冨田 雄一 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (00296568) ; 田原 聰子 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (80296566)
• キーワード: 骨髄 / 幹細胞 / 心筋細胞 / 再生医学

研究概要

骨髄間質細胞を分化誘導することにより心筋細胞を作製し、心不全治療に応用しうるレベルに至るまでの基礎研究を目的とした。心筋細胞にはカテコラミン受容体、アセチルコリン受容体が多数存在し、心拍数・心収縮力の調節、心肥大の促進等の重要な心機能の調節に関与している。本年度は骨髄由来の心筋細胞(CMG細胞)の性質を明らかとするため、CMG細胞のカテコラミン受容体の発現と機能解析を行った。さらに、さまざまに分化した細胞中より心筋細胞のみを単離する方法を開発した。
(1)CMG細胞のカテコラミン受容体の発現:CMG細胞よりRNAを抽出し、カテコラミンα1受容体(α_<1A>、α_<1B>、α_<1D>)およびβ受容体(β_1、β_2)のRT-PCRを行った。CMG細胞をフェニレフリンにて刺激し、ERK1/2の活性化を測定した。さらにα1拮抗薬プラゾシン前処置による抑制効果を観察した。IBMX存在下にイソプロテレノールにより細胞を刺激し、cAMP生成量を測定した。さらにプロプラノロール前処置によるcAMP生成量への影響を検討した。CMG細胞ではα_<1A>、α_<1B>、α_<1D>すべてのα_1受容体が最終分化誘導前より発現していた。フェニレフリンで刺激するとERK1/2の活性化が容量、時間依存性に観察され、この活性化はプラゾシンにより抑制された。β_1受容体、β_2受容体は心筋細胞に分化誘導された後に発現し、イソプロテレノールで刺激すると細胞内cAMPの濃度が容量依存性に増加した。以上よりCMG細胞はカテコラミンα_1、β_1、β_2受容体をmRNAレベルだけでなく蛋白レベルでも発現しかつ生理機能を有していることが観察された。
(2)ミオシン軽鎖-2v遺伝子プロモーターとEGFPの組み換え遺伝子を用いた心筋細胞の単離:心筋細胞特異的に発現するミオシン軽鎖-2v遺伝子プロモーターにEnhanced Green Fluorescent Protein(EGFP) -cDNA遺伝子を組み替えたプラスミドを作製した。この遺伝子組換えプラスミドとNeomycin耐性遺伝子プラスミドをCMG細胞に共遺伝子導入し、G418存在下に細胞を選別した。CMG細胞に5-azacytidineにより最終分化誘導を行い、心筋細胞に分化した細胞のみをFACSによりsortingを行ったところ、CMG細胞は完全な心筋細胞の分画にすることが可能となった。

研究成果

• [文献書誌] Keiichi Fukuda: "IL-6 Family of cytokines mediate angiotensin II-induced cardiac hypertrophy in rodent cardiomyocytes"J.Biol.Chem. 275. 29717-29723 (2000)
• [文献書誌] Keiichi Fukuda: "Calmodulin kinase-II, -IV and calcineurin are involved in leukemia inhibitory factor-induced cardiac hypertrophy in rats"Circ.Res.. 87. 937-945 (2000)
• [文献書誌] Keiichi Fukuda: "Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stem cells for cardiovascular tissue engineering"Artificial Organs.. 25. 183-193 (2001)
• [文献書誌] Keiichi Fukuda: "Potassium Channel Blocker Activates Extracellular Signal Regulated Kinases via Pyk2 and EGF Receptor in Rat Cardiomyocytes K^+ Channel Blocker-Evoked Signals in Cardiomyocyte"Coll Cardiol.. 38. 1554-1563 (2001)
• [文献書誌] Keiichi Fukuda: "ERK and p38MAPK, but not NF-κB, are critically involved in reactive oxygen species-mediated induction of IL-6 by angiotensin II in cardiac fibroblasts"Circ Res. 89. 661-669 (2001)
• [文献書誌] Keiichi Fukuda: "Bone marrow-derived cardiomyocytes(CMG cell) expressed functionally active adrenergic and muscarinic receptors"Circulation. 105. 380-386 (2002)
• [文献書誌] Keiichi Fukuda: "International Symposium of Tissue Engineering for Therapetic Use 4.Y Ikada and Y.Shimizu Edit.Elsevier"Estabishment of Cardiomyogenic Cell Line from Marrow Stroma. (2000)