複製フォーク複合体の形成とその制御機構の研究

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12141203
• 研究機関: 奈良先端科学技術大学院大学
• 研究代表者: 釣本 敏樹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (30163885)
• キーワード: DNAポリメラーゼ / クランプ / クランプローダー / DNAのメチル化 / 質量分析 / チェックポイント / 再構築 / 電子顕微鏡

研究概要

真核生物において複製フォークは、細胞増殖を制御する機構だけでなく細胞増殖を介して娘細胞の機能を決定する機構に深く関与し、それ自身、多様な細胞機能のシグナル伝達ネットワークの中枢を構成する。その中でもクランプとして機能するPCNAは、DNAポリメラーゼ複合体の分子集合と機能制御因子として機能するだけでなく、複製したDNA上で、修復酵素、DNAメチル化酵素、クロマチン集合因子等の多様な因子と相互作用して、これら染色体機能因子と複製フォークの連係役を果たす。本研究ではこれらの分子機構を解明するためPCNAに代表されるクランプとそのクランプをDNAに結合させる活性を持つクランプローダー、RFCに焦点をあて、複製フォークと細胞機能の連係機構について解析した。
まずPCNAレジンを使ったアフィニティークロマトと質量分析の組み合わせにより、ヒト細胞抽出液に含まれるPCNA結合因子の網羅的解析を行った。その結果、既知を含め複製因子、修復因子等10以上のPCNA結合因子が同定できた。この中の一つ、DNAメチル化酵素、Dnmt1とPCNAの相互作用の解析し、DNA上のPCNA特異的にDnmt1が結合をすることを示した。
さらにクランプ-クランプローダー系の多様な機能を理解するため、RFCと類似性がありDNA傷害、複製障害時のチェックポイント機構に関与する因子、Rad17に着目して、これとRFCサブユニット間の複合体を再構築した。同様にPCNAと類似性のあるRad1-Hus1-Rad9複合体の再構築も行った。これらを精製し、機能解析、電子顕微鏡による分子形態の解析を行ったところ、それぞれRFC、PCNAに酷似したリング状構造をとることを示した。これらより、PCNA-RFC以外にも複製進行制御に深く関わるクランプ-クランプローダー系が複製フォーク上で機能していることが強く示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Tadokoro, R. et al.: "Scheduled Conversion of Replication Complex Architecture at Replication Origins of S. cerevisiae during the cell cycle"J Biol Chem.. (In press). (2002)
• [文献書誌] Ishino, Y. et al.: "Functional interaction of an archaeal sliding clamp with mammalian clamp loader and DNA polymerase δ"Genes Cells. 6. 699-706 (2001)
• [文献書誌] Ohki, R. et al.: "In vitro reconstitution of the end replication problem"Mol Cel. Biol.. 21. 5753-5766 (2001)
• [文献書誌] Shikata, K. et al.: "The human homologue of fission yeast cdc27, p66, is a component of active human DNA polymerase δ"J. Biochem.. 129. 699-708 (2001)
• [文献書誌] 釣本敏樹: "生化学誌特集「DNAポリメラーゼ」:DNAポリメラーゼδ"日本生化学会(In press). (2002)