複製開始複合体の形成とその制御機構の解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12141204
• 研究種目: 特定領域研究(B)
• 研究機関: 愛知県がんセンター
• 研究代表者: 藤田 雅俊 愛知県がんセンター, 腫瘍ウイルス学部, 主任研究員 (30270713)
• 研究分担者: 小布施 力史 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (00273855) ; 清野 透 愛知県がんセンター, 腫瘍ウイルス学部, 室長 (10186356)
• キーワード: ヒト細胞 / 複製開始複合体 / 細胞周期 / DNA複製 / ORCタンパク / CDC6タンパク / MCMタンパク

研究概要

本研究の目的は、ヒト細胞における複製開始複合体の形成とその時間空間的制御機構を明らかにすることである。我々はヒト細胞における複製開始蛋白の核内構築とその細胞周期調節についてすでに仮説モデルを提唱しているが、本年度の結果も概ねその妥当性を示俊した。in vivo cross-linkを用いた実験から、ORC/CDC6は非クロマチン核構造上に結合していることがより確かに示された。ORCに関しては、ORC1を含まないsubcomplexがあり、これらは核構造に結合していないことも示唆された。これらは複製以外で機能しているかもしれない。ORC/CDC6がMCM6量体をG1期にクロマチンに結合させると考えられるが、これはORC/CDC6結合部位とは異なるnuclease感受性クロマチンだと考えられる。一方、我々は複製開始蛋白と相互作用している候補蛋白として、RB/E2Fによる転写制御に関与していると考えられるクロマチンリモデリング複合体の一構成蛋白を同定した。その機能解析のために、その蛋白の阻害物質を用いることを考え、その特異性を確実にするため、阻害物質に抵抗性となる変異蛋白を作成し、発現する細胞株の樹立に成功した。今後この系を用いて解析が進むものと期待している。この系を用いて、RB/E2Fによるcyclinの転写制御での、この蛋白の役割も解析できると考えている。ヒト細胞複製単位における複製開始蛋白の結合様式のクロマチン免疫沈降法での解析については、MCMに関してはデータが得られつつあるが、最も重要であると考えているORC1蛋白に関しては、我々の抗体が免疫沈降法に適さず、まだ進捗していない。これに関してはtag付きORC1を安定発現している細胞の樹立に成功した。これを用いることで今後の解析が進むと期待している。

研究成果

• [文献書誌] Arata,Y.: "Cdk2-dependent and -independent pathways in E2F-mediated S phase induction."J.Biol.Chem.. 275. 6337-6345 (2000)
• [文献書誌] Fujii,K.: "The Epstein-Barr virus pol catalytic subunit physically interacts with the BBLF4/BSLF1/BBLF2/3 complex."J.Virol.. 74. 2550-2557 (2000)
• [文献書誌] Yokoyama,N.: "Co-expression of human chaperone Hsp70 and Hsdj or Hsp40 co-factor increases solubility of overexpressed target proteins."Biochim.Biophys.Acta.. 1493. 119-124 (2000)
• [文献書誌] Sawada,M.: "p53 regulates ceramide formation by neutral sphingomyelinase through reactive oxygen species in human glioma cells."Oncogene. (in press).
• [文献書誌] Tatsumi,Y.: "Association of Human Origin Recognition Complex 1 with Chromatin DNA and Nuclease-resistant Nuclear Structures."J.Biol.Chem.. 275. 5904-5910 (2000)
• [文献書誌] Siomi,Y.: "ATP-dependent structural change of the eukaryotic clamp loader protein, RFC."Proc.Nati.Acad.Sci.USA. 97. 14127-14132 (2000)