複製複合体の形成とその制御機構の解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12141204
• 研究機関: 国立がんセンター(研究所)
• 研究代表者: 藤田 雅俊 国立がんセンター, ウイルス部, 室長 (30270713)
• 研究分担者: 小布施 力史 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (00273855) ; 清野 透 国立がんセンター, ウイルス部, 部長 (10186356)
• キーワード: ヒト細胞 / DNA複製開始制御 / サイクリン / CDK / ORC / CDC6 / Cdt1 / MCM / Geminin

研究概要

静止期細胞にE2Fを発現させることによりDNA複製を惹起する系を確立し、E2FはまずMCMのクロマチン結合を引き起こすことを明らかにした。つぎにCDC45のクロマチン結合が起こるが、これにはCdk2活性が必要であることがわかった。
ORC1が核高次構築の基礎としての核マトリックスに結合していることを明らかにした。ORC1抗体で複合体を単離し、それらをmass spectrometryで解析した。その結果等から、ORC1を足場としてG1期特異的に核マトリックス上で機能的ORC1-5複合体が形成されていることが示された。一方、ORCが核マトリックスに結合し、かつ集積してfociを形成しているのとは対照的に、MCM複合体はより広範囲のクロマチンに結合していることがわかった。
MCMが複製終了クロマチンから遊離し、S期以降は再度クロマチン結合されないという機構でDNA再複製は抑制されている。我々等により、CDC6がS期に細胞質に排出されることが示されていたが、その排出は部分的であった。今回、ORC1がS期に分解されることを見出した。一方、S期後期以降はCdc2キナーゼが再複製抑制を担っていること、そしてその機構として、MCMやCDC6の高リン酸化が考えられることを我々は報告してきた。最近Cdt1もMCM loaderとして機能していることが明らかとなってきた。そこでCdc2がCdt1の機能制御を行っている可能性を検討を行した。その結果、Cdc2/cyclinAはCdt1にそのサイクリン結合モチーフを介して結合し、リン酸化を介してCdt1-gemininの結合を調節していることが示唆された。
複製開始蛋白と相互作用している蛋白としてアクチンを同定した。アクチンは、RB/E2Fによる転写制御に関与しているBAFクロマチンリモデリング複合体の構成蛋白であり、また核マトリックス構成成分である可能性も指摘されている。それが核内で機能しているのかどうかという問題は興味深い。アクチンの様に量も多く多機能の蛋白の場合、主に阻害薬剤を用いた実験が行われている。最近ラトルンクリンが特異的阻害剤として多用されている。しかし、薬剤による表現型のすべてがアクチンへの特異的効果によるものかどうかは不明である。この点を解決するために、ラトルンクリンに耐性のある変異アクチンを作成しそれを過剰発現するラトルンクリン抵抗性細胞の樹立を目指し、成功した。

研究成果

• [文献書誌] Fujita, M.et al.: "Nuclear organization of DNA replication initiation proteins in mammalian cells"J.Biol.Chem.. 277. 10354-10361 (2002)
• [文献書誌] Fujita, M.et al.: "Establishment of latrunculin A-resistance in HeLa cells by expression of a R183A D184A mutant β-actin"Oncogene. 22. 627-631 (2003)
• [文献書誌] Kodoh, A.et al.: "Reactivation of lytic replication from Epstein-Barr virus latently infected B-cells occurs with high S-phase CDK activity while inhibiting cellular DNA replication"J.Virol.. 77. 851-861 (2003)
• [文献書誌] Tadokoro, R.et al.: "Scheduled Conversion of Replication Complex Architecture at Replication Origins of S.cerevisiae during the cell cycle"J.Biol.Chem.. 277. 15881-15889 (2002)
• [文献書誌] Sawada, M.et al.: "Acid sphingomyelinase activation requires caspase-8 but not p53 nor reactive oxygen species during Fas-induced apoptosis in human glioma cells"Exp.Cell Res.. 273. 157-168 (2002)
• [文献書誌] Tsurumi, T., Fujita, M.: "Molecular basis for Epstein-Barr virus DNA replication"Curr.Top.Virol.. (In press).