ヌクレオチド除去修復反応の細胞内調節機構に関する研究

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12143202
• 研究種目: 特定領域研究(B)
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 松永 司 金沢大学, 薬学部, 助教授 (60192340)
• 研究分担者: 二階堂 修 金沢大学, 薬学部, 教授 (60019669)
• キーワード: DNA損傷 / ヌクレオチド除去修復 / DDB / シクロブタン型ピリミジンダイマー / (6-4)光産物 / ゲルシフトアッセイ / 試験管内修復反応 / XPA

研究概要

本年度は、DDB(damaged-DNA binding protein)の機能に関する解析を中心に行い、以下のような成果を得た(文献3)。まず、p48サブユニットとp127サブユニットの各々のcDNAをpFASTBac1ベクターにサブクローニングし、リコンビナントバキュロウィルスを作製した。これをSf21昆虫細胞に共感染させ、そこからリコンビナントDDBヘテロダイマーをほぼ均一に精製した。シクロブタン型ピリミジンダイマー(CPD)、あるいは(6-4)光産物(6-4PP)を1箇所に含むDNAを基質とした試験管内修復反応を行い、DDBが切断効率に及ぼす影響について調べた。細胞粗抽出液にはDDB活性を欠損しているチャイニーズハムスターAA8細胞から調製したものを使用した。その結果、CPDの基質を用いたときにのみDDBによる切断効率の促進が見られた。さらに、ゲルシフト法を用いて各基質との結合性を調べたところ、これまでの報告どおり6-4PPに対して最も強い親和性を示したが、CPDに対してもコントロールより高い親和性が見られた。また、CPDの基質を用いて、他の修復因子と組み合わせてゲルシフトアッセイを行ったところ、XPAあるいはXPA+RPAと混合したときに複合体の形成が観察された。そこで、DDBとXPAとのタンパク間相互作用の可能性を考え、プルダウンアッセイを行った。その結果、両者の間に相互作用が確認され、主にp48との相互作用に依存していることが示された。以上の結果より、DDBはCPDに結合した後、XPAの損傷部位への導入を促し、その結果として修復効率を上昇させることが示唆された。近年、細胞レベルの実験からDDBはCPDのゲノム全体からの修復(GGR:global genomic repair)に働くことが示唆されており(Hwang et al,1999;Tang et al,2000)、本実験の結果はこのメカニズムを試験管内系で示したものと考える。
今後は、DDBの促進作用に細胞粗抽出液中の未知因子が関与(介在)していないか、試験管内再構成系で確認する必要がある。また、このメカニズムが細胞レベルでも実証できるか調べる予定である。

研究成果

• [文献書誌] Ohtoshi,E.: "Respective roles of cyclobutane pyrimidine dimers, (6-4) photoproducts and minor photoproducts in UV mutagenesis of repair deficient xeroderma pigmentosum A cells."Cancer Res.. 60(6). 1729-1735 (2000)
• [文献書誌] Torizawa,T.: "DNA binding mode of the Fab fragment of a monoclonal antibody specific for cyclobutane pyrimidine dimer."Nucleic Acids Res.. 28(4). 944-951 (2000)
• [文献書誌] Yokoyama,H.: "Crystal structure of the 64M-2 antibody Fab fragment in complex with a DNA dT (6-4) T photoproduct formed by ultraviolet radiation."J.Mol.Biol.. 299(3). 711-723 (2000)
• [文献書誌] Perdiz,D.: "Distribution and repair of bipyrimidine photoproducts in solar UV-irradiated mammalian cells. Possible role of Dewar photoproducts in solar mutagenesis."J.Biol.Chem.. 275(35). 26732-26742 (2000)
• [文献書誌] Tanaka,M.: "Effects of photoreactivation of cyclobutane pyrimidine dimers and pyrimidine (6-4) pyrimidone photoproducts on ultraviolet mutagenesis in SOS-induced repair-deficient Escherichia coli."Mutagenesis. 16(1). 1-6 (2001)
• [文献書誌] Wakasugi,M.: "DDB stimulates the excision of cyclobutane pyrimidine dimers in vitro in concert with XPA and RPA."J.Biol.Chem.. (in press). (2001)