| 研究概要 |
本研究の主たる目的は,プロトンポンプ(H+, K+-ATPase)のイオン認識・輸送機序およびポンプの細胞内移動機構を分子レベルで解明することである。ポンプのαサブユニットは膜を10回貫通し、βサブユニットは膜を1回貫通する。これらのサブユニットの役割として,1)どの部位(複数)がプロトン・カリウムイオンを認識するか,イオンを輸送する部位であるかを解明する2)細胞内におけるポンプ生合成後の細胞内輸送に関わる部位を明らかにすることにある。
本年度は、αサブユニットおよびβサブユニットを安定的に発現するHEK細胞株を構築することに成功した。この細胞株において、ポンプ機能が原形質膜に発現することを確認した。αサブユニット単独で発現させると、αサブユニットは原形質膜に移行せず、ユビキチン化修飾を受け、proteasomeにより消化されることがわかった。βサブユニット単独で発現させると、単独でも、細胞膜表面に移行することがわかった。また、ユビキチン化修飾も受けない。ついで、βサブユニットのS-S結合の細胞内局在化機構において果たす役割についての研究を行った。βサブユニットの細胞外領域に3個のS-S結合がある。S-S結合に関与するCysをSerに換えたmutantを構築した。3個のS-S結合を1個でものぞくと、α/β複合体は形成されず、α-、β、-サブユニットの細胞表面への移動が見られなくなり、α鎖、β鎖ともにERにとどまり、酵素活性も消失した。
αサブユニットの6番目の膜貫通部位がイオン認識に果たす役割を調べた。6番目の貫通部位全てのアミノ酸残基を1残基置換した多くのmutantを作成し、その機能の変化を調べた。αサブユニットの4,5,6番目の膜貫通部位からなるイオン認識部位に対して、コンピュータ3次元モデルを構築し、検討した。
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