短寿命活性種をシグナルとするセクサー蛋白質の構造と機能

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12147205
• 研究種目: 特定領域研究(B)
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 小林 一雄 大阪大学, 産業科学研究所, 助手 (30116032)
• キーワード: 酸化ストレス / SoxR / X線結晶構造解析 / 鉄イオウクラスター / 転写制御

研究概要

本研究では大腸菌における酸化ストレスに対する応答に関与する遺伝子の発現調節に関わる調節因子であるSoxRに注目し、SoxRのX線結晶構造解析を目的として、結晶化を試みてきた。しかしながら、このタンパク質は高濃度の塩が存在しないと溶解せず、また塩存在下でもSoxRタンパク質がaggregateし易いことが分かった。そこでSoxRタンパク質をN末から89残基からなるSoxSのプロモター領域に結合し、転写活性部位と考えられるタンパク質と、C末から71残基の酸化還元中心である鉄イオウクラスターを持つ転写調節部位を別々に大量発現させた。wild型SoxRはダイマーで存在するのに対して、DNA結合部位を持つ前者のタンパク質はモノマーで存在し、SoxRと同様なDNA結合能(K_d〜10^<10>M)を有した。一方後者の転写調節部位であるタンパク質はDNA結合能は全く見られず、wild SoxRと同様な鉄イオウクラスターによる特徴的な吸収スペクトルおよびEPRスペクトルを与えた。またその鉄イオウの酸化還元電位は-290mVと求めることができ、SoxRの電位(-283mV)とそれほど変わらない値を持つことが確かめられた。このことは、SoxRタンパク質が転写制御部位と調節部位にそれぞれ異なるドメインを有し、いずれのタンパク質ともnativeなSoxRと同様なコンフォメーションを持っていることが分かった。それぞれタンパク質の結晶化を試み、結晶が得られた。特にDNA結合部位タンパクについては、分解能2.0Åまでの回折強度データを収集できた。

研究成果

• [文献書誌] M.Tsubaki,K.Kobayashi,T.Ichise,F.Takeuchi,and S.Tagawa: "Diethylpyrocarbonate-Modification Abolishes Fast Electron Accepting Ability of Cytochrome b_<561> from Ascorbate but Does Not Influence on Electron Donation to Monodehydroascorbate Radical"Biochemistry. 39. 3276 (2000)
• [文献書誌] S.Suzuki,H.Furusawa,K.Kataoka,K.Yamaguchi,K.Kobayashi,S.Tagawa: "Intramolecular Electron Transfer Process of Native and Mutant Forms of Blue Copper-containing Nitrite Reductase from Alcaligenes xylosoxidans"Inorg.Reac.Mech.. 135. 2129 (2000)
• [文献書誌] T.Hirano M.Hirobe,K.Kobayashi,O.Yamauchi,Y.Satow,and T.Nagano: "Mechanism of Superoxide Dismutase-Like Activity of Fe (II) and Fe (III) Complexes of Tetrakis-N,N,N',N'(2-pyridylmethyl) ethylenediamine"Chem.Pharm.Bull.. 48. 223 (2000)
• [文献書誌] S.Fujii,K.Kobayashi,S.Tagawa,and T.Yoshimura: "Reaction of Nitric Oxide with Iron (III) Complex of N-(Dithiocarboxy) sarcosine"J.Chem.Soc.Dalton Trans.. 3310 (2000)
• [文献書誌] K.Kobayashi,S.Tagawa, and T.Mogi: "Transient Formation of Ubisemiquinone Radical and Subsequent Electron Transfer Process in the Escherichia coli Cytochrome bo"Biochemistry. 40. 15620 (2000)