短寿命活性種をシグナルとするセンサー蛋白質の構造と機能

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12147205
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 小林 一雄 大阪大学, 産業科学研究所, 助手 (30116032)
• キーワード: 金属センサー / 転写因子 / 短寿命活性種 / X線構造解析 / パルスラジオリシス / 活性酸素

研究概要

生体内においては、酸化ストレスが増大すると、防御修復系タンパク質が誘導活性化される現象がみられる。大腸菌においてはSoxRSレギュロンが酸化ストレスの防御修復機能の役割を担っており、その中でSoxRタンパク質は酸化ストレスに対するセンサーとして防御修復遺伝子の発現を調節している。SoxRタンパク質はN末端側のDNA結合ドメインと鉄イオウクラスターを含む転写制御ドメインからなる単量体が二量体として機能し鉄イオウクラスターの酸化還元により転写制御を行っていると考えられている。本研究ではSoxRの転写制御機能を原子レベルで明らかにすることを目的としてSoxRタンパク質の結晶化とX線回折実験を行った。結晶化はSoxRタンパク質に加えてDNA結合ドメイン、鉄イオウクラスタードメインの分断タンパク質の結晶化を行った。その結果、DNA結合ドメインについては、沈殿剤としてMPDを用い、20℃において蒸気拡散法で行ったときに、柱状の結晶を得ることができた。この結晶を用いて、シンクロトロン放射光(SPring-8)による回折実験を行ったところ、2.0Å分解能を越える反射を確認できた。現在結晶化条件の最適化および重原子置換体の検索を行っている。またSoxRとそのアミノ酸配列が相同性の高いMerR familyタンパク質として、最近そのX線構造解析が明らかになったBmrRの構造を基に分子置換法を現在進めている。一方鉄イオウクラスタードメインについては、沈殿剤としてPEG6000を用い結晶を得ることができた。この結晶を用いて、シンクロトロン放射光(SPring-8)による回折実験を行ったところ、3.10Å分解能の反射を確認できた。現在、重原子誘導体およびFe原子を利用したMAD法による構造解析を進めている。

研究成果

• [文献書誌] F.Takeuchi, K.Kobayashi, S.Tagawa, M.Tsubaki: "Ascorbate Protects the Carbethoxylation of Two Histidyl and One Tyrosyl Residues Indispensable for the Transmembrane Electron Transfer Reaction of Cytochromeb_<561>"Biochemistry. 41. 4067 (2001)
• [文献書誌] K.Kobayashi, A.Koppenhofer, S.J.Ferguson, N.J.Watmough, S.Tagawa: "Intramolecular Electron Transfer from c Heme to d_1 Heme in Bacterial Cytochrome cd_1 Nitrite Reductase Occurs over the Same Distances at very Different Rates Depending on the Source of the Enzyme"Biochemistry. 41. 8542 (2001)
• [文献書誌] H.Nakajima, E.Nakagawa, K.Kobayashi, S.Tagawa, S.Aono: "Ligand-Switching intermediates for the CO-Sensing Transcriptional Activator CooA Measured by Pulse Radiolysis"J.Biol.Chem.. 276. 37895 (2001)
• [文献書誌] K.Kobayashi, S.Tagawa, S.Daff, I.Sagami, T.Shimizu: "Rapid Calmodulin-Dependent Interdomain Electron Transfer in Neuronal Nitric-Oxide Synthase Measured by Pulse Radiolysis"J.Biol.Chem.. 276. 39864 (2001)