蛋白質-蛋白質相互作用情報の系統的解析

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12206004
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 伊藤 隆司 金沢大学, がん研究所, 教授 (90201326)
• 研究分担者: 住本 英樹 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (30179303)
• キーワード: 2ハイブリッド法 / GIドメイン / PBIドメイン / PXドメイン

研究概要

昨年度に引き続き、下記の課題を検討した。
1)相互作用領域同定法2ハイブリッドフットプリント法の確立
2)相互作用変異体作製法の開発
3)複合体精製用タンデムアフィニティタグの導入・開発とタギング株の作製
4)新規相互作用ドメインの構造機能解析
5)相互作用系の種を越えた普遍性の検証
結果は下記の通り。
1)相互作用領域同定法である2ハイブリッドフットプリント法の開発を進行中。組み換え反応に加えてPCRによる段階欠失導入法を検討し、より均一な欠失変異体集団の作製条件を検討している。
2)デュアルベイト逆2ハイブリッド法を開発し、高次構造を大きく破壊せずに相互作用のみを選択的に障害する変異の同定を可能にした。この方法は、平変異導入対象の融合蛋白質の存在をそのC末に付加したドメインを認識する2つ目のベイトとの相互作用で保証することで、ナンセンス変異や不安定化変異を自動的に除外するものであり、その有効性は既にGCN1-GCN2相互作用系におけるGIドメインの標的領域の解析等で実証されている。
3)TAP(Tandem Affinity Purification)タグを導入した。PCRを用いたノックイン法を利用して、出芽酵母の全WWドメイン蛋白質のタギング株を作製、谷口研にて解析中。全SH3ドメイン蛋白質のタギングも進行中。また変性条件下での使用が可能な独自のTAPタグを開発、オリジナルTAPタグと性能を比較検討中。細胞破砕条件の検討も進行中。
4)酵母細胞極性決定系から発見したPB1ドメインとPCモチーフによるBEM1とCDC24の相互作用の役割を独自のドメインスワッピング法で証明した。
5)哺乳類好中球活生酸素生成系および細胞極性決定系でのPB1-PC相互作用系の機能解析も進めている。
一方、同じ酵母細胞極性決定系・哺乳類好中球活性酸素生成系から発見したPB2/PXドメインのが新規phosp hoinositide結合ドメインであることを見い出し、細胞レベルでの機能も解析している。

研究成果

• [文献書誌] Ito, T., Chiba, T., Ozawa, R., Yoshida, M., hattori, M., Sakaki: "A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome"Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 98. 4569-4574 (2001)
• [文献書誌] Kubota, H., Ota, K., Sakaki, Y., Ito, T.: "Budding yeast GCN1 binds the GI domain to activate the eIF2alpha kinase GCN2"J. Biol. Chem.. 276. 17591-17596 (2001)
• [文献書誌] Hiroaki, H., Ago, T., Ito, T., Sumimoto, H., Kohda, D.: "Solution structure of the PX domain, a target of the 5H3 domain"Nature Struct. Biol.. 8. 526-530 (2001)
• [文献書誌] Ito, T., Matsui, Y., Ago, T., Ota, K., Sumimoto, H.: "Novel modular domain PB1 recognizes PC motif to mediate functional protein-protein interactions"EMBO J.. 20. 3938-3946 (2001)
• [文献書誌] Terasawa, H., Noda, Y., Ito, T., Hatanaka, H., Ichikawa, S.et al.: "Structure and ligand recognition of the PB1 domain : a novel protein module binding to the PC motif"EMBO J.. 20. 3947-3956 (2001)
• [文献書誌] Ago, T., Takeya, R., Kuribayashi, F., Hiroaki, H., Ito, T., et al.: "The PX domain as a novel phosphoinositide-binding module"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 287. 733-738 (2001)