| 研究課題/領域番号 |
12206007
|
|---|
| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
|---|
研究代表者 |
小笠原 直毅 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (10110553)
|
|---|
| 研究分担者 |
小林 和夫 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (70324978)
笠原 康裕 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (20273849)
守夜 成紀 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (40191051)
河村 富士夫 立教大学, 理学部, 教授 (10126039)
吉川 博文 東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (50175676)
|
|---|
| キーワード | 枯草菌 / 蛋白質相互作用 / 蛋白質複合体 / 酵母2ハイブリッド系 / GFP / 変異株バンク / ゲノム解析 |
|---|
| 研究概要 |
細胞増殖期に常に発現しているために転写制御ネットワークの解析手法では解析が難しいと思われる増殖制御因子(細胞分裂・複製関連蛋白質、分子シャペロン、また、多くのゲノムに保存されている機能未知蛋白質等)を出発点として蛋白質相互作用を複数の方法で解析し、枯草菌蛋白質間の相互作用情報の収集、蓄積を進めると共に各解析法を改良、組み合わせて、より効率良い網羅的解析法の確立を目指すことが本研究の目的である。第一の方法は、T7タグ付加遺伝子を導入した枯草菌細胞をin vivoでクロスリンカーを用いて架橋し、T7抗体カラムを用いてT7タグ付加蛋白質を含む複合体を単離する方法で、実際に必須遺伝子を中心に100遺伝子についてタグ配列を付加した。現在までに35株を解析し、15株から共精製される蛋白質を認めた。しかし、その収量が低かったためか、質量分析計による蛋白質の同定には至っていない。第二の方法は、酵母2ハイブリッド系によるスクリーニングで、機能未知必須遺伝子25、分子シャペロン9、転写因子4等を含む48 baitを作製し、昨年度構築した枯草菌ゲノムライブラリーから相互作用を示すクローンを得た。第三は細胞生物学的にFRETによって枯草菌生細胞内で直接蛋白質相互作用を検出する方法で、そのために枯草菌で機能する2種のGFP色変異体、CFPとYFP、を作製した。現在、相互作用既知の蛋白質に両GFP色変異体を融合させ、この方法の評価を行っている。第四は遺伝的手法による解析で、致死性を示すような変異の組み合わせを探索する。そのために、枯草菌全遺伝子の変異株バンクを完成させた。その結果、LB培地、37度の培養条件での必須遺伝子は276であることが明らかになった。また、タイタープレートを用いた枯草菌の形質転換法を確立し、多数の変異の組み合わせが容易に解析できるようになった。
|
