脳皮質形成の分子基盤の解明

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12210135
• 研究機関: 東京慈恵会医科大学
• 研究代表者: 仲嶋 一範 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (90280734)
• キーワード: 電気穿孔法 / 遺伝子導入法 / 脳皮質形成 / 神経細胞移動 / 子宮内胎児操作

研究概要

中枢の神経細胞は、各々の誕生部位から移動し、形態や誕生時期等の共通の特徴を持った細胞同士が集合して、皮質各層などの構造を作って局在しているため、その分子基盤を明らかにする目的で以下の研究を行った。まず、発生各時期の胎児大脳のRNAを調製して、各種細胞接着分子のコンセンサス領域に作成した変性プライマーを用いてRT-PCRを行った。得られた混合産物をクローン化し、フィルター上にブロットし、differential hybridizationを行って、時期特異的に発現しているクローンを複数得た。得られた候補分子群の配列決定とともに、実際の発現様式を現在確認している段階である。また、発生期において細胞が移動・配列する機構を解析する上では、移動する神経細胞を、周囲の(移動を終了した)成熟神経細胞群から区別して同定することが非常に重要であるが、現在そのような簡便な手法は存在しない。そこで、移動細胞のみに任意の外来遺伝子を発現させ、かつ可視化する新しい手法の開発を試みた。まずは、電気穿孔法を子宮内胎児に適用して、プラスミドの状態の外来性の遺伝子を胎児脳に導入する新しい技術を開発した。この手法により、脳内の神経細胞が発生過程でさかんに産生され移動する時期(マウスでは胎生12〜17日頃)において、子宮から胎児を摘出することなく遺伝子導入を行い、更にそのまま子宮内で発生を続けさせることが可能になった。green fluorescent protein(GFPを組み込んだベクターをこの方法で導入することにより、脳内の細胞移動を容易に可視化することができた。特にCMVプロモーターを含むコンストラクトをこの方法で導入すると、(移動を終了した)成熟神経細胞には発現がみられず、移動中の細胞のみで発現することを見いだした。これにより、移動細胞を周囲の成熟神経細胞と区別して可視化することに成功した。

研究成果

• [文献書誌] Joseph W.Yip: "Reelin controls position of autonomic neurons in the spinal cord"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.. 97. 8612-8616 (2000)
• [文献書誌] Naoko Utsunomiya-Tate: "Reelin molecules assemble together to form a large protein complex, which is inhibited by the function-blocking CR-50 antibody"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.. 97. 9729-9734 (2000)
• [文献書誌] Hidenori Tabata: "Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brains using electroporation-Visualization of neuroual migration in the developing cortex"Neuroscience. (印刷中).
• [文献書誌] Kazunori Nakajima: "Development of the mouse model dramatype for human clinical benefit"Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats. (印刷中).
• [文献書誌] 仲嶋一範: "神経細胞の移動と皮質の構築"脳神経科学イラストレイテッド(森寿 他 編). 114-122 (2000)
• [文献書誌] 仲嶋一範: "大脳皮質層構造が形成されるメカニズム"神経化学. (印刷中).
• [文献書誌] 仲嶋一範: "ニューロンの位置決定メカニズム"日本生化学会「バイオサイエンスの新世紀」脳の発生・分化・可塑性. (印刷中).