高発がん性遺伝病の原因遺伝子NBS1の機能解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12213087
• 研究種目: 特定領域研究(C)
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 小松 賢志 広島大学, 原爆放射能医学研究所, 教授 (80124577)
• 研究分担者: 田内 広 広島大学, 原爆放射能医学研究所, 助手 (70216597) ; 松浦 伸也 広島大学, 原爆放射能医学研究所, 助教授 (90274133)
• キーワード: NBS / AT / NBS1 / 電離放射線 / dsb / ATM / テロメア / フォーカス

研究概要

1)NBS1遺伝子の機能ドメイン:NBS1遺伝子のN末側は多くの生物種で保存されていることから重要機能を持ったドメインと考えられている。このため、N末側蛋白を欠損したdeletion mutant実験を行い、その核移行能力やシグナル伝達、DNA鎖切断点でのフォーカス形成能に与える効果を検討する。また、これらのドメインDNAをtwo hybridアッセイ系に組み込んで相互作用する遺伝子をスクリーニングした。
2)NBS1のシグナル伝達:一方、放射線照射後のNBS1遺伝子発現誘導とその蛋白質並びにp53リン酸化能をアッセイする。放射線5Gy照射後1〜8時間経時的にNBS細胞及び正常リンパ芽球細胞蛋白のサンプリングを行って、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離、続いてNBS1及びp53リン酸抗体(N末側認識)を用いてウェスタンブロットによりその変化をser343及びp53(ser15)リン酸化をNBS及び正常リンパ芽球細胞リン酸化能について比較検討した。
3)テロメアー短縮:さらに正常線維芽細胞をネガティブコントロールそしてA-T細胞をポジティブコントロールとしてテロメアー短縮を比較する。テロメアー短縮は抽出DNAをHinflそしてRsal酵素処理後電気泳動して(CCCTAA)3オリゴヌクレオチドをプローブとしたサザンブロッティングによりテロメアー長(TRF)を測定する。またテロメアー短縮に対する放射線効果も同時に検討した。
4)抗体を用いたdsb認識フォーカス形成:また、放射線照射後のNBS1フォーカス形成の局在と経時変化、並びにDNA-PKcsフォーカスとの集合離散によりdsb再結合に於ける両遺伝子の細胞内機能を推定する。放射線2Gy照射後8時間迄のNBS患者及び正常ヒト線維芽細胞を固定、DNAをDAP1、NBS1抗休をFITC,DNA-PKcsをテキサスレッド標識により染色後レーザー顕微鏡でフォーカスを検出する。また、解像度を上げるために低張処理によるDNA繊維上のNBS1蛋白及びDNA-PKcsの会集合がdsb部位で起こっていることを確認した。
5)nbs1遺伝子ターゲッティング:最後にNBS1のエキソン3〜4の2候補部位について変異をPGK-neo-polyAとHSV-tk遺伝子を用いてターゲッティングベクターに導入する。これらのターゲッティング・ベクターDNAをエレクトロポレーション法によりES細胞に導入後、G418及びGANC選択を行う。続いて相同組換え体を確認した変異ES細胞を増殖後、C57BL/6の3.5日胚から回収したブラストシスト内に注入用ピペットを用いて移入する。さらに偽妊娠ICRマウスの子宮内に戻して、17日後に生まれて来るキメラマウスの交配によりF_1を得る。最終的にはマウス尾DNAを抽出し、PCR法によりNBS1変異マウスを同定した。

研究成果

• [文献書誌] H.Tauchi, et.al.: "The FHA domain of NBS1 is essential for nuclear foci formation after irradiation, but not essential for hRAD50/hMRE11/NBS1 complex DNA repair activity."J.Biol.Chem.. 276. 12-15 (2001)
• [文献書誌] J.P.Winter, et.al.: "Isolation of a cDNA representing the Fanconi anemia complementation group E gene."Am.J.Hum.Genet.. 67. 1306-1308 (2000)
• [文献書誌] S.Matsuura, et.al.: "Chromosomal instability syndrome of total premature chromatid separation with mosaic variegated aneuploidy is defective in mitotic-spindle checkpoint."Am.J.Hum.Genet.. 67. 483-486 (2000)
• [文献書誌] H.Tauchi, et.al.: "Mutation spectrum of MSH3-deficient cells HHUA/chr.2 refrects in vivo activity of the MSH3 gene product in mismatch repair."Mutat.Res. 447. 155-164 (2000)
• [文献書誌] S.Hama, et.al.: "Absence of mutation in the NBS1 gene inn B-cell malignant lymphoma patients. "Anticancer Res.. 20. 1897-1900 (2000)
• [文献書誌] T.Ohnishi, et.al.: "Heat-induced accumulation of p53 and hsp72 is suppressed in lung fibroblasts from SCID mouse."Int.J.Radiat.Biol.. 76. 711-715 (2000)