| 研究課題/領域番号 |
12215149
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
千葉桜 拓 東京農業大学, 応用生物科学部, 助教授 (30227334)
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| 研究分担者 |
吉川 博文 東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (50175676)
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| キーワード | 哺乳動物細胞 / 細胞周期 / Gl / S遷移 / サイクリンA / サイクリン依存性キナーゼ(CDK) / 基質ターゲティング / 酵母2ハイブリッド系 / タンパク質間相互作用 |
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| 研究概要 |
サイクリンAはCDK2と結合して、動物細胞が新たな増殖を決定するGl/S遷移期を制御すると考えられているが、その時期におけるサイクリンA-CDK2特異的かつ必須な作用基質は未知である。我々はそのような基質を解明する端緒として、Gl/S遷移期特異的な基質へCDK2をターゲットする機能を欠損していると考えられるサイクリンAの「ターゲティング変異体」を2種分離し、これらの変異型サイクリンAの機能解析、および野生型・変異型サイクリンAとの相互作用を指標としたライブラリー検索を行っている。
2種の変異型サイクリンAの機能解析として、既にサイクリンA-CDK2によりリン酸化されることが知られており、Gl/S期における主要なCDK基質であるRbに対する作用をin vivoで解析した結果、いずれの変異型サイクリンAもCDKをRbヘターゲットしてリン酸化する機能は野生型と同様であり、Rb以外にGl/S遷移期特異的なサイクリンAの作用基質が存在することが示唆された。
サイクリンAと相互作用する因子のライブラリー検索として、酵母2ハイブリッドスクリーニングを開始した。その際、全長サイクリンAは酵母で発現させると致死となるので、サイクリンボックスを除いたC末端領域をbaitとして用いた。このC末領域baitは致死とならず、また他のサイクリンに保存されているサイクリンボックスを含まないので、特異的なスクリーニングに有用と考えられた。まず野生型サイクリンAをbaitとして用いたスクリーニングを行った結果、約190種の陽性クローンが得られた。現在、それぞれのクローンにつきbaitを変異型に交換し、変異型に対して陰性となるクローンを選択することによって、特異的な相互作用因子の同定を行っている。
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