核多角体病耐性カイコの創出

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12306002
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 伴戸 久徳 北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (20189731)
• 研究分担者: 岡野 和広 理化学研究所, 微生物制御研究室, 基礎科学特別研究員 (70322691) ; 松本 継男 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 教授 (40107355) ; 田村 俊樹 蚕糸・昆虫農業技術研究所, 遺伝育種部・遺伝子工学研究室, 室長(研究職)
• キーワード: トランスジェニック / BmNPV / IE1 / アンタゴニスト / カイコ / トランスポゾン / piggyBac / RNAi

研究概要

カイコにBmNPV耐性を付与する方法の一つとして、ウイルスの増殖に必要な因子の発現を抑制させることが考えられる。前年度はNPVの必須制御因子IE1のアンタゴニストにより培養細胞に置いてNPVの増殖が効果的に抑制されることを明らかにした。しかし、この方法のみで個体におけるウイルス増殖を効果的に抑制することは難しいと考えられたため、さらに他のウイルス必須因子についても発現抑制法を開発した。
遺伝子の発現を抑制する方法として、2本鎖RNAを用いてRNAiを引き起こす方法が効果的であることが報告されている。そこで、このRNAiを利用して、ウイルスゲノムの複製に必須な遺伝子(lefl及びdnahel)の発現を抑制することを試みた。カイコ細胞を用いた一過性発現系により解析したところ、各遺伝子配列を持つ2本鎖RNAを発現させた細胞にウイルスを感染させた場合、感染に伴うウイルスゲノムの増加はleflの発現を抑制した場合において1/2、dnahelの発現を抑制した場合において1/3に抑制された。またいずれにおいても細胞外へのウイルス放出量が顕著に減少した。これらのことから2本鎖RNAによりlefl及びdnahel遺伝子の発現が抑制されることで、ウイルスの増殖が抑制されることが明らかとなった。
一方、piggyBacを用いたマイクロインジェクション法に改良を加えて遺伝子導入効率を飛躍的に高めることに成功した。そこで、改良マイクロインジェクション法を用いて上記の2本鎖RNA発現ユニット及びIE1のアンタゴニスト発現ユニットをカイコの卵に導入し、遺伝子組換えカイコを作成した。現在これらの組換えカイコのNPV耐性について解析を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Quan, G.X., Kanda, T., <Tamura T.>_-: "Introduction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene"Insect.Molec.Biol.. (in press). (2002)
• [文献書誌] <Tamura, T.>_-, Quan, G.X., Kanda, T., Kuwabara, N.: "Transgenic silkworm research in Japan : Recent progress and future"Proceeding of Joint International Symposium of Insect COE Research Program and Insect Factory Research Project. 77-82 (2001)
• [文献書誌] <Okano, K.>_-, Shimada, T., Mita, T., Maeda, S.: "Comparative expressed-sequence-tag analysis of differential gene expression profiles in BmNPV-infected BmN cells"Virology. 10 ; 282(2). 348-356 (2001)
• [文献書誌] Kojima, K., Hayakawa, T., Asano, S., <Bando, H.>_-: "Tandem repetition of baculovirus ie1 promoter results in upregulation of transcription"Archives of Virology. 146. 1-8 (2001)
• [文献書誌] Isobe, R., Kojima, K., Sahara, K., Asano, S., <Bando, H.>_-: "Antisense and double-strand RNA interference in a silkworm ovarian cell line"Journal of Insect Biotechnology and Sericology. (in press). (2002)