| 研究課題/領域番号 |
12306002
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
伴戸 久徳 北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (20189731)
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| 研究分担者 |
松本 継男 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 教授 (40107355)
田村 俊樹 蚕糸昆虫農業技術研究所, 遺伝子工学研究室, 室長
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| キーワード | カイコ / RNAi / NPV / ウィルス耐性 / piggyBac / DNAマイクロアレイ / primase / helicase |
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| 研究概要 |
本年度は、2本鎖RNAがRNAiを誘導することを利用してカイコにBmNPV耐性を付与することを試みた。まず、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として、カイコ細胞において2本鎖RNAを用いた標的遺伝子発現抑制技術を開発した。次に、2本鎖RNAがウイルスの遺伝子発現に及ぼす影響を詳細に解析するために、BmNPVのすべての遺伝子を網羅したDNAマイクロアレイを開発し、ウイルス遺伝子発現モニタリング・システムを確立した。これらの後、ウイルスの必須遺伝子lef-(primase)、p143、(helicase)配列を有する2本鎖RNA発現ユニットを構築し、トランスポゾンpiggyBacシステムを用いて蚕の卵巣由来の培養細胞(BmN)に導入後、セルソーターを用いてトランスジェニック細胞(Tg細胞)をスクリーニングした。Tg細胞にBmNPVを感染させ、導入遺伝子の効果についてDNAマイクロアレイを用いて解析したところ、標的ウイルス遺伝子の発現が抑制されることが明らかとなった。また、Tg細胞においてはBmNPVの増殖は効果的に抑制され、NPV耐性トランスジェニックカイコ細胞の作出に成功した。さらに、これらの2本鎖RNA発現ユニットをPiggyBacヘルパープラスミドとともにカイコの卵に注射しすることで、これらの発現ユニットを導入したTgカイコの作出に成功した。得られたいくつかのTgカイコ系統を用いてTgカイコにおけるBmNPVの増殖をコントロール(非Tgカイコ)と比較したところ、感染4日目のTgカイコ体液中におけるウイルス量はコントロールの十分の1以下に抑えられていることが判明した。以上、2本鎖RNAによるBmNPV遺伝子の発現抑制技術の開発に成功し、2本鎖RNA発現4ニットをpiggyBacシステムを利用してカイコに導入することで、BmNPV耐性カイコの作出に成功した。
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