| 研究課題/領域番号 |
12307016
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
小川 聡 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (90124940)
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| 研究分担者 |
伯野 大彦 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (80286476)
高橋 栄一 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (00276247)
福田 恵一 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (20199227)
冨田 雄一 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (00296568)
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| キーワード | 心筋細胞 / 再生医学 / 骨髄細胞 / 細胞移植 / 心不全 / 発生 |
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| 研究概要 |
(1)CMG細胞のカテコラミン受容体の発現:
最終分化誘導前および5-Azacytidineによる分化誘導後1-6週のCMG細胞よりRNAを抽出した。マウス心臓を陽性対照にカテコラミンα1受容体(α_<1A>、α_<1B>、α_<1D>)およびβ受容体(β_1、β_2)のRT-PCRを行った。分化誘導前および誘導後2週のCMG細胞をフェニレフリン(α_1agonist)にて刺激し、ERK1/2の活性化を測定した。CMG細胞におけるカテコラミン受容体の発現を解析するとα1受容体の3種のサブタイプの内、α_<1A>、α_<1B>、α_<1D>すべてが最終分化誘導前より発現していた。さらに、CMG細胞をフェニレフリンで刺激するとMAPKの1種であるERK1/2の活性化が容量、時間依存性に観察され、この活性化はα1遮断薬であるプラゾシンにより抑制された。β受容体に関してはβ_1受容体、β_2受容体の両者が心筋細胞に分化誘導された後に発現された。CMG細胞をβ刺激薬であるイソプロテレノールで刺激すると細胞内cAMPの濃度が容量依存性に増加していた。以上よりCMG細胞はカテコラミンα_1、β_1、β_2受容体をmRNAレベルだけでなく蛋白レベルでも発現しかつ生理機能を有していることが観察された。
(2)ミオシン軽鎖-2v遺伝子プロモーターとEGFPの組み換え遺伝子を用いた心筋細胞の単離:
心筋細胞特異的に発現するミオシン軽鎖-2v遺伝子のプロモーターにEnhanced Green Fluorescent Protein (EGFP-cDNA遺伝子を組み替えたプラスミドを作製した。この遺伝子組換えプラスミドとNeomycin耐性遺伝子プラスミドをCMG細胞に共遺伝子導入し、G418存在下に細胞を選別した。CMG細胞に5-azacytidineにより最終分化誘導を行い、心筋細胞に分化した細胞のみをFACSによりsortingを行ったところ、CMG細胞は完全な心筋細胞の分画にすることが可能となった。
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