2001 年度実績報告書

立体構造に基くカルパインの活性化機構の解析

研究課題

研究課題/領域番号	12308032
研究機関	(財)東京都老人総合研究所
研究代表者	鈴木紘一 (財)東京都老人総合研究所, 所長 (80011948)
研究分担者	反町洋之東京大学, 農学部・生命科学研究科応用生命科学専攻, 助教授 (10211327) 猪股光司 (財)東京都老人総合研究所, 分子生物学系・蛋白質生化学部門, 研究員 (30142649) 岩下淑子 (財)東京都老人総合研究所, 分子生物学系・蛋白質生化学部門, 室長 (50111498) 前田達哉東京大学, 分子細胞生物研究所, 助教授 (90280627)
キーワード	カルパイン / カルシウム / プロテアーゼ / 活性化機構 / 蛋白質の構造変化 / 蛋白質の高次構造
研究概要	カルパインの高次構造解析の結果に基づき、ドメインIとIIの機能を解析した。I(1-18)はヘリックス領域で、その塩基性アミノ酸Lys-5とArg-12は、ドメインVIのAsp-154およびGlu-260とそれぞれ塩様結合をしている。これらを部位特異的に変異したもの、およびN末端近辺を特異的に切断した変異体を用いて解析し、二本の塩様結合がなくなると、カルシウム感受性が上昇し、活性化状態になることを証明した。IとVI間の二本の塩様結合は、VIがカルシウムを結合すると切れるので、昨年度の結果とあわせ、IはドメインIIIと協調してドメインIIを左右に引っ張り構造を変形させ、不活性にする重要な役割をもつことを証明した。また、Iは活性化に伴う自己消化で切断されるが、この切断は活性化自体には直接必要ないことを明らかにした。これらの結果、ドメインIIはIとIIIが関係する塩様架橋のために正しい構造が取れず活性をもたないが、カルシウムを添加すると、塩様架橋が切れてIIが正しい構造を取り活性が発現すると予想した。これを証明するため、IIを単独で発現して活性を検討したところ、予想に反してIIはカルシウム存在下でのみ活性を示した。胃に特異的なカルパインで、ドメインIIだけからなるnCL-2'の活性を同様に調べたところ、nCL-2'の活性もカルシウム依存的であった。従って、カルパインに対するカルシウムの効果は少なくとも二段階に分かれ、分裂しているドメインIIの構造を大きく変化させる段階と、その構造をさらに微調整して活性型の構造に変化させる段階があることが判明した。第二段階に対応するカルシウム結合部位はドメインII内に存在するはずで、この新しいカルシウム結合構造の同定と機能の解析が今後の問題である。

研究成果
(11件)

すべてその他

すべて文献書誌 (11件)

[文献書誌] Tompa, P.: "Domain III of calpain is a Ca^<++>-regulated lipid-binding domain"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 280. 1333-1339 (2001)
[文献書誌] Futai, E.: "Molecular cloning of PalBH, a mammalian homologue of the Aspergillus atypical calpain PalB."Biochem. Biophys. Acta. 1517. 316-319 (2001)
[文献書誌] Sorimachi, H.: "The structure of calpain."J Biochem.. 129. 653-664 (2001)
[文献書誌] Reverter, D.: "Structural basis for possible calcium-induced activation mechanism of calpain."Biol. Chem.. 382. 653-664 (2001)
[文献書誌] Hata, S.: "Domain II of m-calpain is a Ca^<2+>-dependent cysteine protease."FEBS Letters. 501. 111-114 (2001)
[文献書誌] Reverter, D.: "The structure of calcium-free m-calpain implications for calcium activation and function."Trends Cardiovasc. Med.. 11. 222-229 (2001)
[文献書誌] Hata, S: "Both the conserved and the unique gene structure of stomach-specific calpains reveal processes of calpain gene evolution."J. Mol. Evol.. 53. 191-203 (2001)
[文献書誌] Nakagawa, K.: "Dissociation of m-calpain subunits occurs after autolysis of the N-terminus of the catalytic subunit, and is not required for activation."J. Biohem.. 130. 605-611 (2001)
[文献書誌] 秦勝志: "カルパインスーパーファミリーの構造と機能"生化学. 73. 1129-1140 (2001)
[文献書誌] 反町洋之: "筋ジストロフィーとカルパイン"蛋白質核酸酵素. 46. 1772-1780 (2001)
[文献書誌] 鈴木紘一: "カルパインファミリーメンバーの構造と疾患"Molecular Medicine. 39. 10-17 (2002)

2001 年度 実績報告書

立体構造に基くカルパインの活性化機構の解析

研究代表者

鈴木 紘一 (財)東京都老人総合研究所, 所長 (80011948)

研究成果

[文献書誌] Tompa, P.: "Domain III of calpain is a Ca^<++>-regulated lipid-binding domain"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 280. 1333-1339 (2001)

[文献書誌] Futai, E.: "Molecular cloning of PalBH, a mammalian homologue of the Aspergillus atypical calpain PalB."Biochem. Biophys. Acta. 1517. 316-319 (2001)

[文献書誌] Sorimachi, H.: "The structure of calpain."J Biochem.. 129. 653-664 (2001)

[文献書誌] Reverter, D.: "Structural basis for possible calcium-induced activation mechanism of calpain."Biol. Chem.. 382. 653-664 (2001)

[文献書誌] Hata, S.: "Domain II of m-calpain is a Ca^<2+>-dependent cysteine protease."FEBS Letters. 501. 111-114 (2001)

[文献書誌] Reverter, D.: "The structure of calcium-free m-calpain implications for calcium activation and function."Trends Cardiovasc. Med.. 11. 222-229 (2001)

[文献書誌] Hata, S: "Both the conserved and the unique gene structure of stomach-specific calpains reveal processes of calpain gene evolution."J. Mol. Evol.. 53. 191-203 (2001)

[文献書誌] Nakagawa, K.: "Dissociation of m-calpain subunits occurs after autolysis of the N-terminus of the catalytic subunit, and is not required for activation."J. Biohem.. 130. 605-611 (2001)

[文献書誌] 秦 勝志: "カルパインスーパーファミリーの構造と機能"生化学. 73. 1129-1140 (2001)

[文献書誌] 反町洋之: "筋ジストロフィーとカルパイン"蛋白質核酸酵素. 46. 1772-1780 (2001)

[文献書誌] 鈴木紘一: "カルパインファミリーメンバーの構造と疾患"Molecular Medicine. 39. 10-17 (2002)

2001 年度実績報告書

鈴木紘一 (財)東京都老人総合研究所, 所長 (80011948)

[文献書誌] 秦勝志: "カルパインスーパーファミリーの構造と機能"生化学. 73. 1129-1140 (2001)