| 研究課題/領域番号 |
12440191
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| 研究機関 | 理化学研究所 |
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研究代表者 |
尾高 雅文 理化学研究所, バイオ工学研究室, 研究員 (20224248)
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| 研究分担者 |
片山 葉子 東京農工大学, 農学部, 助教授 (90165415)
養王田 正文 東京農工大学, 工学部, 助教授 (50250105)
遠藤 勳 宇都宮大学, 農学部, 教授 (00087470)
丹生谷 博 東京農工大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (60135936)
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| キーワード | システインスルフェン酸 / システインスルフィン酸 / 非ヘム鉄蛋白質 / 翻訳後修飾 / ニトリルヒドラターゼ / チオシアネート加水分解酵素 |
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| 研究概要 |
ニトリルヒドラターゼ(NHase)は、システインスルフィン酸(Cys-SO_2H)とシステインスルフェン酸(Cys-SOH)というシステイン酸化体を配位子とする新規金属蛋白質である。このシステイン酸化体を含む新規金属結合モチーフの機能を明らかにするために、本年度は以下の研究を行った。
(1)阻害剤による反応メカニズム解析-昨年度、研究代表者らは、イソブチロニトトリル中には、鉄型NHaseをCys-SOH配位子をCys-SO_2Hに酸化して失活させる微量の不純物質が含まれていることを明らかにした。本年度は、この不純物質をNMR、GC-MSによって解析し、2-cyano-2-propyl hydroperoxide((CH3)_2-C(CN)-00H ; CPH)であることを明らかにした。CPHの添加による鉄型NHaseのUV-Vis吸収スペクトルおよびESRスペクトルの変化から、CPHは非ヘム鉄活性中心と安定な結合をし、鉄イオンを3価から2価に還元する事がわかった。以上ことから、CPHは非ヘム鉄と相互作用して安定な複合体を形成する一方で、Cys-SOH配位子を酸化して酵素を不活性化してしまう、新規な自殺基質であると結論した。
(2)チオシアネート加水分解酵素(SCNase)とコバルト型NHaseのESR解析-SCNaseはコバルトを中心金属とし、少なくともCys-SO_2H配位子の修飾は保存されていることがわかっているNHaseファミリーに属する酵素である。本年度はSCNaseとRhodococcus rhodochorous J1由来コバルト型NHaseのESR解析を行った。どちらもESR silentであり、還元するとESRシグナルを示すことから、低スピン9価のコバルトをもつ単核のセンターであるが、どちらの酵素においても環境がわずかに異なる2糠類のセンターが存在することが考えられた。mimsENDOR測定の結果、鉄型NHaseと異なり、SCNaseとコバルト型NHaseでは第6配位子に結合しているプロトンのシグナルが弱く、プロトンが結合していても固定されていないことが予測された。また、3pulseESEEMの結果、主鎖のアミド窒素がコバルトに配位していることが予測された。以上のことから、第6配位子のプロトンの挙動に違いがあるものの、SCNaseおよびコバルト型NHaseの金属反応中心の構造は、鉄型NHaseと極めてよく似ていることが明らかとなった。
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