| 研究課題/領域番号 |
12440191
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
尾高 雅文 理化学研究所, バイオ工学研究室, 先任研究員 (20224248)
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| 研究分担者 |
片山 葉子 東京農工大学, 農学部, 助教授 (90165415)
養王田 正文 東京農工大学, 工学部, 助教授 (50250105)
遠藤 勲 宇都宮大学, 農学部, 教授 (00087470)
丹野谷 博 東京農工大学, 遺伝子実験施設, 教授 (60135936)
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| キーワード | システインスルフェン酸 / システインスルフィン酸 / 非ヘム蛋白質 / 翻訳後修飾 / ニトリルヒドラターゼ / チオシアネート加水分解酵素 |
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| 研究概要 |
1.水和されにくい基質と報告されているイソバレロトリル(IVN)とNHaseとの相互作用を検討した。IVNは同程度の分子量を持つ他のニトリルに対して1/10のKmと1/50のVmaxを示した。NHaseはIVNを加えると非ヘム鉄に由来する可視吸収が一時的に長波長シフトするが、このときのスペクトルはシクロヘキシルイソシアニド(cyclo-NC)結合型酵素のそれに酷似していた。そのため市販IVN試薬を分析したところ、不純物の一つとしてイソブチロイソシアニド(IVNC)が同定された。さらに、NHaseに1当量のt-ブチルイソシアニド(t-BuNC)を加えたところ、IVNや呼cyclo-NCと同様な長波長シフトを生じ、約5分間でもとのスペクトルに回復した。以上の結果は、市販IVN試薬中に混在しているIVNCがNHaseと相互作用していること、また、NHaseがイソシアニド化合物を水和していることを示唆している。これはNHaseの新しい触媒活性を見出したものである。
2.SCNaseはコバルト型NHaseファミリーに属する酵素で、Cys-SO_2H修飾を有する。SCNase遺伝子をサブクローニングし、大腸菌で全蛋白質の5%まで可溶性画分に発現した。得られた蛋白質はネイティブと同じ化学両論比で複合体を形成していたが、Co含量は0.05Co atom/SCNaseであり、Cys-SO_2Hの修飾を受けている蛋白質は全体の1%程度であった。また、SCNase活性はネイティブ酵素の0.5%程度であった。以上の結果は、発現した組み換え蛋白質はSCNaseのアポ型酵素であることを示している。NHaseファミリーにおいてアポ型酵素の調製に成功した例はこれまでなく、本成果からNHaseファミリーに属する酵素への金属の導入過程に関する知見が得られることが期待される。
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