| 研究課題/領域番号 |
12440191
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
無機化学
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
尾高 雅文 独立行政法人理化学研究所, バイオ学研究室, 先任研究員 (20224248)
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| 研究分担者 |
片山 葉子 東京農工大学, 農学部, 助教授 (90165415)
養王田 正文 東京農工大学, 工学部, 助教授 (50250105)
遠藤 勲 宇都宮大学, 農学部, 教授 (00087470)
丹生谷 博 東京農工大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (60135936)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2002
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| キーワード | システインスルフィン酸 / システインスルフェン酸 / 非ヘム蛋白質 / 翻訳後修飾 / ニトリルヒドラターゼ / チオシアネート加水分解酵素 / 金属シャペロン / 非コリンコバルト蛋白質 |
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| 研究概要 |
ニトリルヒドラターゼ(NHase)は非ヘム鉄または非コリンコバルトを活性中心とする金属酵素である。研究代表者らは、鉄型NHaseがシステインスルフィン酸(Cys-SO_2H)とスルフェン酸(Cys-SOH)というシステイン酸化体を含む新規金属結合モチーフを有することを明らかにした。これらの成果をもとに、本研究課題では、NHaseならびにNHaseと高い相同性を示す酵素チオシアネート加水分解酵素(SCNase)を材料とし、システイン酸化体を含む新規金属結合モチーフの機能に関する研究を行った。
1.イソブチロニトリル(IBN)はNHaseに対して数μMで競争阻害作用を示すことが報告されていた。その阻害効果を新たに検討し直したところ、IBN自体は単なる基質であり、市販IBN試薬中に含まれる來雑物である2-cyano-2-propylhydroperoxide(Cpx)が真の阻害剤であることが明らかになった。Cpxは鉄型NHaseのCys-SOH残基を特異的に酸化し、不可逆的に失活させることを明らかにした。また、NHaseの安定化剤として知られ、その精製、保存、多くの研究に使用されているn-酪酸の機能を解析した。その結果、n-酪酸非存在下での酵素の失活はCys-SO_2Hへの空気酸化が原因であること、n-酪酸はαCys114-SOHの酸化を防ぐことで酵素を安定化していることを明らかにした。以上の結果は、αCys114のSOH基が酵素活性の発現に重要であること結論された。
2.Co型NHaseならびにSCNaseにおいても、Cys-SO_2Hの修飾が保存されていることを明らかにした。また、SCNaseがコバルト型NHaseファミリーに属すること、さらにアポ体の発現系に成功した。アポ型酵素に関しては、良好な結晶化条件を決定しており、立体構造解析を開始した。
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