| 研究課題/領域番号 |
12450332
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
中野 秀雄 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 助教授 (00237348)
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| 研究分担者 |
民谷 栄一 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 教授 (60179893)
山根 恒夫 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 教授 (70026102)
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| キーワード | 無細胞タンパク質合成系 / 一分子PCR / 蛍光蛋白質 / PCR / ライブラリー / マイクロアレイ / 一本鎖抗体 / ハイスループット |
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| 研究概要 |
タンパク質およびペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA分子集団を希釈し、マイクロリアクタ(ウェル)上に1分子/リアクタになるよう分散させ、そのDNA1分子をPCRにより増幅、続けて無細胞転写翻訳共役反応を行わせ、タンパク質・ペプチド分子ライブラリを構築する技術を開発することを目的として以下のような研究を行った。
1)マイクロリアクタアレイ上での1分子PCRのに関する検討:ガラス基盤上に作製されたアレイ(容量0.45nl、1平方cm当たり1200ウェル)で、PCRを行い、TaqMan蛍光プローブにより検出したところ、DNA増幅が確認できた。
2)無細胞タンパク質合成系によるタンパク質・ペプチドの合成に関する検討:非天然型アミノ酸(ニトロフェニルアラニン)を、クラゲ蛍光タンパク質の蛍光中心である66位に導入した蛋白質を大腸菌無細胞蛋白質合成系により合成した。次にこの残基と3次元的に接する148位と205位にランダム変異を導入し、一分子PCRにより384穴プレート上でクローン化し、スクリーニングを行った。
66位にニトロフェニルアラニンを導入したライブラリーでは、蛍光を発する変異体は得られなかったが、66位が野生体と同じGFPのライブラリーを作製したところ、数種の野生体とは蛍光特性が異なるものが得られた。すなわち一分子PCRと無細胞タンパク質合成系によるライブラリーシステムが、有効に機能することを示した。同様な検討を分子内SS結合を有する一本鎖抗体で行ったところ、様々なアフィニティを示す抗体ライブラリーを384穴プレート上で構築することができた。なおこの際用いた大量の大腸菌S30抽出液はハイスピード冷却遠心機を用いて調製した。
また、環状ペプチドを合成させるため、Twinシステムを用いて組み替えプラスミドを構築した。大腸菌に導入し誘導をかけて、キチンビーズにて精製後、環状化し高速液体クロマトグラフで解析した。
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