マイクロリアクタアレイによる超高密度タンパク質・ペプチド分子ライブラリの構築

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12450332
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 中野 秀雄 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 助教授 (00237348)
• 研究分担者: 民谷 栄一 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 助教授 (60179893) ; 山根 恒夫 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 教授 (70026102)
• キーワード: 無細胞タンパク質合成系 / 一分子PCR / GFP / ライブラリー / ビーズ / 均一性

研究概要

本研究では、タンパク質およびペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA分子集団を希釈し、マイクロリアクター(ウェル)上に1分子/リアクターになるよう分散させ、そのDNA1分子をPCRにより増幅、続けて無細胞転写翻訳共役反応を行わせることで、タンパク質・ペプチド分子ライブラリーを構築する技術(SIMPLEX : single-molecule-PCR-linked in vitro expressions)を開発し、さらにより高密度なアレイ上でのタンパク質分子ライブラリーの構築を目指して研究を行った。以下に本年度の成果の概要を記す。
1)ライブラリーサイズの拡大に関する検討:一分子PCRでは一つのウェルに平均1分子ずつ分配するため、分子が分配されないウェルも存在する。そこで1ウェル当たり多分子分配し、それを均一に増幅できるかどうかについて検討した。その結果平均5分子程度であれば、それぞれの分子を均一に増幅できるPCR条件を設定することができた。そのため1ウェルで多数の変異サンプルのスクリーニングすることが可能になり、ライブラリーサイズを簡単に拡大することができた。この方法を用いて抗ヒト血清アルブミン単鎖抗体のCDRに変異を導入したライブラリーを構築し、迅速にスクリーニングできることを示した。
2)高集積タンパク質分子ライブラリー構築法の検討:磁性マイクロビーズ上にPCR増幅産物をPCRあるいはビオチン-アビジンの結合力を利用して固定化した。これをマイクロチャンバーアレイと呼ばれる、容積が1plであるチャンバーが2cm×2cm中に250,000個整列したアレイ上に1ビーズ/チャンバーで分注した後、無細胞転写・翻訳反応液を塗布し反応を行わせ、蛍光顕微鏡で観察した。その結果ビーズが存在するアレイにだけGFPの蛍光が検出されたことより、非常に集積度の高いタンパク質分子ライブラリーの構築に成功した。

研究成果

• [文献書誌] Jiang et al.: "Expression of Fab fragment of catalytic antibody 6D9 in an Escherichia coil in vitor coupled transcription/translation system"FEBS Letters. 514. 290-294 (2002)
• [文献書誌] Nakano et al.: "In vitro combinatorial mutagenesis of the 65^<th> and 22^<nd> position of the green fluorescent protein of Aequarea Victoria"Biotechnology and Bioprocess Engineering. 7. 311-315 (2002)
• [文献書誌] Koga et al.: "In vitro construction and screening of a Burkholderia cepacia lipase library using single-molecule PCR and cell-free protein synthesis"Journal of Bioscience and Bioengineering. 94,1. 84-86 (2002)
• [文献書誌] Rungpragayphan et al.: "High-throughput, cloning-independent protein library construction by combining single-molecule DNA amplification with in vitro expression"Journal of Molecular Biology. 318. 395-405 (2002)
• [文献書誌] Rungpragayphan et al.: "PCR-linked in vitro expressions : A novel system for high-throughput construction and screening of protein libraries"FEBS letters. (印刷中).