| 研究課題/領域番号 |
12450332
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物・生体工学
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
中野 秀雄 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 助教授 (00237348)
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| 研究分担者 |
民谷 栄一 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究所, 教授 (60179893)
山根 恒夫 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 教授 (70026102)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2002
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| キーワード | 無細胞タンパク質合成系 / 蛋白質ライブラリー / 一分子PCR / マイクロチャンバーアレイ / リパーゼ / GFP / ハイスループットスクリーニング / 抗体 |
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| 研究概要 |
本研究では、タンパク質およびペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA分子集団を希釈し、マイクロリアクター(ウェル)上に1分子/リアクターになるよう分散させ、そのDNA1分子をPCRにより増幅、続けて無細胞転写翻訳共役反応を行わせることで、タンパク質・ペプチド分子ライブラリーを構築する技術(SIMPLEX : single-molecule-PCR-linked in vitro expression)を開発し、さらにより高密度なアレイ上でのタンパク質分子ライブラリーの構築を目指して研究を行った。その結果、一段階PCRによる一分子PCR法の確立し、簡便化を実現した.得られるライプラリーは、各サンプルの合成量が非常に均一で従来法の生細胞を用いて得られるものより、遥かに質の高いものであることを示した.さらに多分子のPCRが可能であり、1つのウェルで多種類同時に合成およびアッセイできることをしめした。これらの成果により、非常にハイスループットなタンパク質・ペプチドライブラリー構築およびスクリーニングシステムであるSIMPLEX法を確立できたと考えている.このシステムを用いて、クラゲ蛍光タンパク質および抗体の変異体の取得に成功した.また1cm^2あたり10,000個の高集積化したチャンバーアレイ上でのタンパク質合成に成功し、高集積化への道を開いた.一方In vitro combinatorial mutagenesis法を開発し、変異ライブラリー取得においてタンパク質の立体構造情報に基づく変異箇所の限定および組み合わせ変異の導入が非常に効果的であることを、微生物リパーゼおよびGFPを例に示した.
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