グリコシダーゼの分子機構および分子進化に関する研究

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12460035
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 森 春英 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (80241363)
• 研究分担者: 福士 幸治 北海道大学, 大学院・農学研究科, 講師 (60218906) ; 木村 淳夫 北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (90186312)
• キーワード: α-グルコシダーゼ / グリコシダーゼ / 分子進化

研究概要

我々は、α-グルコシダーゼが異なる一次構造・基質認識を有する2つのファミリー(I型とII型)に分類できることを見い出した。糖質酵素では例のない"収斂進化"である。さらに、I型ファミリーの構造はα-アミラーゼなどと類似し、"発散進化"と捉えられる。II型酵素にも"発散進化"が見られ、α-キシラナーゼとα-グルカンリアーゼの構造と類似する。これらの事実は、α-グルコシダーゼファミリーの構造・機能に関する微視的な解析が、グリコシダーゼに適用できることを暗示する。本課題の目的は、ファミリー間の基質認識・機作の相違をアミノ酸レベルから分子解剖し、得た知見を相同のグリコシダーゼに発展させることである。本年度は以下に示す研究成果が得られた。計画は順調に進行している。
(1)昨年度にI型ファミリー酵素で触媒残基と推定したアミノ酸の組換え体の精製に成功した。比活性が完全に消失し、触媒残基と確認できた。機能解析のため、組換え体(Asp→Ala/Gly、Glu→Ala/Gly、精製迅速化のためHis_6-tagを付した)を作製した。基質取り込みやChemical Rescueを解析し、触媒反応における求核基とプロトンドナー決定を行っている。
(2)両ファミリーに属す酵素に関し、結晶化を試みた。立体構造が未知なII型ファミリー酵素において結晶が得られたので、結晶化の条件検討を行っている。
(3)II型のファミリー酵素(分裂酵母由来)に完全保存されているTrpを各種アミノ酸に置換した。オリゴ糖への作用が変化しており、現在、精製を行っているが、基質のアグリコン部分認識に関与するTrpを決定できると期待している。基質グリコンの水酸基への認識解析のため、2,3,4,6位の-OH基のデオキシ基質を合成した。両ファミリー酵素の作用を比較している。グルカールの水和反応はII型酵素によりなされ、I型酵素は水和できないことが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] M.Okuyama: "Carboxyl Group of Asp-647 Residues as Possible Proton Donorin Catalytic Activities of α-1,6- and α-1,4-Glucosidic Linkages"Eur.J.Biochem.. 268・8. 2270-2280 (2001)
• [文献書誌] M.Nishimoto: "Purification and Substrate Specificity of Honeybee, Apismellifera L., α-Glucosidase III"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 65・7. 1610-1616 (2001)
• [文献書誌] T.Mizuno: "Isolation and Sequence of α-Glucosidase Gene from Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum Strain 0407"J.Appl.Glycosci. 48・3. 287-291 (2001)
• [文献書誌] A.Kimura: "Reaction Mechanism of Glycosylase"Trends In Glycosci.Glycotechnol.. 13. SA-BO1J-SA-B01J (2001)
• [文献書誌] J.-H.Lee: "Purification and Identification of Essential Ionizable Groups of Honeybee, Apismellifera L., Trehalase"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 65・12. 2657-2665 (2001)
• [文献書誌] Y.-M.Kim: "Production of Maltopentaose and Biochemical Characterization of Maltopentaose-Forming Amylase"J.Microbiol.Biotechnol.. 11・4. 636-643 (2001)
• [文献書誌] H.Mori: "Modulation of Activity and Substrate Binding Modes by Mutation of Single and Double Subsites +1/+2 and -5/-6 of Barley α-Amylase 1"Eur.J.Biochem.. 268・24. 6545-6558 (2001)
• [文献書誌] M.Okuyama: "Catalytic Amino Acid Residue Providing Proton Donar in α-Glucosidase Family II"J.Appl.Glycosci.. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] M.Okuyama: "α-Glucosidase Mutant Catalyzes α-Glucosynthase-type Reaction"Biosci.Biotechnol.Biochem.. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] T.Takayanagi: "Evaluation of Subsite Affinities of Isomalto-dextranase from Arthrobacter globiformis"J.Appl.Glycosci.. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] K.Fukuda: "Kinetic Studies on Substrate Specificity and Active Site of β-D-Glucosidase F_I from Streptomyces sp."J.Appl.Glycosci.. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] M.Nishimoto: "Study on Three α-Glucosidase Isozymes from Honeybee,Apis mellifera L."J.Appl.Glycosci.. (印刷中). (2002)