グリコシダーゼの分子機構および分子進化に関する研究

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12460035
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 森 春英 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (80241363)
• 研究分担者: 福士 幸治 北海道, 大学院・大学院・農学研究科, 講師 (60218906) ; 木村 淳夫 北海道, 大学院・大学院・農学研究科, 教授 (90186312)
• キーワード: α-グルコシダーゼ / グルコシダーゼ / 分子進化

研究概要

(1)α-グルコシダーゼの自殺酵素であるコンズリトールBエポキシド(CBEと略)をI型酵素に作用させ、1分子のCBEが1分子の酵素に結合することで失活することが判明した。CBEが結合する酸性アミノ酸を決定でき、触媒反応において解離し反応中間体であるオキソカルベニウムイオンを安定化させると想像された。相同酵素のα-アミラーゼにおいても解離型の触媒基との知見がある。
(2)基質グリコンのデオキシ基質を合成し、I型とII型酵素の作用を比較した。I型酵素はデオキシ基質を加水分解できなかったが、II型酵素はグルコースの2-OHがデオキシとなった基質に作用できた。グリコンの2-OHの認識が両酵素群で異なることが明らかになった。
(3)糖転移作用の高いI型酵素が存在する。転移能を高めている蛋白構造を究明するため、全アミノ酸配列の保存性が約7割の酵素とキメラ酵素を構築した。作製した多数のキメラ酵素の活性が低く、遺伝子発現の際に活性部位に糖鎖が付加したと考えられ、付加モチーフの破壊を行う必要がある。
(4)II型ファミリーに属す2つの酵素の結晶が得られた。
(5)II型酵素の相同酵素であるα-キシラナーゼ遺伝子の発現に成功した。我々が明らかにしたII型α-グルコシダーゼの3つの触媒基が作動していると判断された。I型酵素と相同のα-アミラーゼにおいて基質との結合に重要なMet残基の決定を行った。
(6)本研究でα-グルコシダーゼの2つのファミリーにおける基質認識の相違を構造の視点で分子解析できた点は大きな成果であった。さらに両ファミリーが発散進化した相同酵素において、α-グルコシダーゼで得られた分子レベルの知見が適用可能であることが判明した。

研究成果

• [文献書誌] M.Okuyama: "Catalytic Amino Acid Residue Providing Proton Donar in α-Glucosidase Family II"J. Appl. Glycosci.. 49・2. 211-219 (2002)
• [文献書誌] M.Nishimoto: "Study on Three α-Glucosidase Isozymes from Honeybee, Apis mellifera L"J. Appl. Glycosci.. 49・2. 191-197 (2002)
• [文献書誌] M.Okuyama: "Mutant Catalyzes α-Glucosynthase-type Reaction"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 66・4. 928-933 (2002)
• [文献書誌] T.Takayanagi: "Evaluation of Subsite Affinities of Isomalto-dextranase from Arthrobacter globiformis"J. Appl. Glycosci.. 49・2. 123-127 (2002)
• [文献書誌] K.Fukuda: "Kinetic Studies on Substrate Specificity and Active Site of β-D-Glucosidase F1 from Streptomyces sp"J. Appl. Glycosci.. 49・3. 265-272 (2002)
• [文献書誌] K.Fukuda: "Identification of Essential Ionizable Groups and Evaluation of Subsite Affinities in the Active Site of j3-D-Glucosidase F1 from Streptomyces sp"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 66・10. 2060-2067 (2002)
• [文献書誌] T.Nishio: "Glycon Specificity Profiling of α-Glucosidase Using Monodeoxy and Mono-O-methyl Derivatives of p-Nitrophenyl α-D-Glucopyranoside"Carbohydr. Res.. 337・7. 629-634 (2002)
• [文献書誌] H.Mori: "Barley α-Amylase Met53 Situated at the High-affinity Subsite -2 Belongs to a Subsrate Binding Motif in the α→β Loop 2 of the Catalytic (β/α)_8-Barre and Is Critical for Activity and Substrate Specificity"Eur. J. Biochem.. 269・22. 5377-5390 (2002)
• [文献書誌] B.Svensson: "Fascinating Facets of Function and Structure of Amylolytic Enzymes of Glycoside Hydrolase Family 13"Biologia. 57・Suppl 11. 5-19 (2002)
• [文献書誌] M.Son: "Evidence of Intramolecular Transglucosylation Catalyzed by an α-Glucosidase"J. Appl. Glycosci.. 50・1. 41-44 (2003)
• [文献書誌] San San Mar: "Purification, Characterization, and Sequence Analysis of Two α-Amylase Isoforms from Azuki Bean, Vigna angularis, Showing Different Affinity towards β-Cyclodextrin"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 67(印刷中). (2003)