| 研究概要 |
前年度に引き続き、Thermus thermophilusで強力に機能するS-layer遺伝子のプロモーターを利用した発現ベクターの開発を行った。S-layer遺伝子は、構造遺伝子の上流に、分泌シグナル、および細胞表層への結合シグナル領域を有しているので、これらを利用した外来遺伝子の分泌発現用ベクター、菌体表層でのdisplay型発現ベクターも併せて作製した。
これら3種の発現ベクターに、超好熱菌Pyrococcus horikoshii OT3株由来の6遺伝子を連結し、T.thermophilus HB27株での発現を試みた。その結果、菌体外への分泌や菌体表層での発現は認められず、すべての発現が菌体内でのみ認められた。しかし、それらの発現レベルは、従来型のベクターを用いた発現レベルと比較して著しく高いものであった。特に、これまで大腸菌では発現が全く認められていなかったα-mannosidase遺伝子が、T.thermophilusで効率的に発現することが認められた。また、aminopeptidase,endoglucanaseの2遺伝子についても、大腸菌での発現レベルを上回る高発現が確認された。
P.horikoshiiの遺伝子を対象とした場合には、分泌型ベクターを用いても菌体外への分泌発現が認められなかったので、菌体外酵素であることが知られているBacillus stearothermophilusのα-amylase遺伝子を上述の発現ベクターに連結し、T.thermophilusでの分泌発現の可否を検討した。その結果、S-layerのシグナルおよびα-amylaseのシグナルのいずれを用いた場合でも、α-amylaseの菌体外への分泌発現が認められた。これは、T.thermophilusにおける異種遺伝子の菌体外分泌発現の最初の成功例である。
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