酵母ゴルジ体の機能制御のための分子機構解析

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12460040
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 依田 幸司 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (20143406)
• 研究分担者: 野田 陽一 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助手 (90282699) ; 足立 博之 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (00211699)
• キーワード: 酵母 / 小胞輸送 / ゴルジ体 / 膜タンパク質 / 局在化機構 / GDP-mannose輸送体 / Sed5タンパク質 / Tlg2タンパク質

研究概要

酵母細胞を用いて、ポリトピックな膜タンパク質のゴルジ体early領域局在に必要な配列の解析と、ゴルジ体諸領域を分取しそのタンパク質構成を二次元電気泳動およびTriton X-114分画後の膜タンパク質の解析から行って、学術的に興味深い新知見を得た。
ポリトピック型膜蛋白質のGDP-mannoseトランスポーターVig4については、C末端に存在する親水性領域がゴルジ体early領域への局在に大きく関与しているという前年度の成果に基づき、詳細な検討を進めた。本領域を含むGST融合タンパク質がコートマー成分δ-COPと結合したので、そのアミノ酸配列をさまざまに変化させたものについても検討し、多数存在するリジン残基の位置と数が結合に強く関係することを示した。δ-COPとの結合が低下した配列をVig4に移すと、結合力の低下に応じて細胞内でゴルジ体から液胞に誤って輸送されるものが増えた。輸送の各種温度感受性変異株を用いて、野生型Vig4が小胞体-ゴルジ体間をダイナミックに移動していることを確認した。
ゴルジ体のearly領域とlate領域にそれぞれ局在する膜タンパク質であるSed5とTlg2にmycエピトープを付けたものをもつ菌株を造成し、その細胞破砕液から、これらのタンパク質を表面に提示している膜小胞を、モノクローン抗体で吸着回収した。こうして回収されるタンパク質は二次元電気泳動によって200余のスポットに分けることが出来た。各スポットのタンパク質を、トリプシン分解とMALDI-TOF-MSによるペプチドマッピングで同定した。既知のゴルジ体マーカータンパク質とともに、シャペロンを初めとする多種類の可溶性タンパク質が再現性をもって回収され、オルガネラとこれらの細胞質タンパク質の相互作用に興味が持たれた。膜タンパク質に絞った解析からは、新規なゴルジ体局在性膜タンパク質が発見された。

研究成果

• [文献書誌] K.Yoda, Y.Noda: "Vesicular transport and the Golgi apparatus in yeast"Journal of Bioscience and Bioengineering. 91(1). 1-11 (2001)
• [文献書誌] Y.Kosodo, K.Imai, A.Hirata, Y.Noda, A.Takatsuki, H.Adachi, K.Yoda: "Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae"Yeast. 18(11). 1003-1014 (2001)
• [文献書誌] H.Kadokura, H.i Kawasaki, K.Yoda, M.Yamasaki, K.Kitamoto: "Efficient export of alkaline phosphatase overexpressed from a multicopy plasmid requires degP, a gene encoding a periplasmic protease of Escherichia coli"Journal of General and Applied Microbiology. 47(3). 113-141 (2001)
• [文献書誌] J.-H.Cho, Y.Noda, H.Adachi, K.Yoda: "A novel membrane protein complex on the endoplasmic reticulum and early Golgi compartments in the yeast Saccharomyces cerevisiae"Bioscience, Biotechnol, and Biochemistry. 65(10). 2226-2232 (2001)
• [文献書誌] H.Inadome, Y.Noda, H.Adachi, K.Yoda: "A novel protein Mpm1 of the mitochondria of the yeast Saccharomyces cerevisiae"Bioscience, Biotechnol, and Biochemistry. 65(11). 2577-2580 (2001)