染色体の分断による最小ゲノム酵母の創製と応用

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12460044
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 原島 俊 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (70116086)
• 研究分担者: 金子 嘉信 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (90161182)
• キーワード: 酵母 / 最小ゲノム / 染色体分断 / 遺伝子破壊

研究概要

申請者らは、染色体の自在な操作によるゲノムの大規模改変技術を開発し、酵母の育種や最小ゲノム酵母の創製、ゲノムの構築原理の解明などに応用するため、染色体を任意の位置で分断する新しい染色体工学技術を開発してきた。従来の分断ベクターは、1つのセントロメア、2対の逆向きに配置したテロメア、酵母形質転換体の選択符号からなる1断片型分断ベクターであり、分断部位が異なるごとに、標的配列をPCRで増幅し、分断ベクターにクローン化する必要があった。こうした方法は、多数の分断を効率良く行うためには不適である。そこで、1種の分断ベクターで多数の部位を分断できるように、酵母の染色体上に約200コピー散在するデルタ配列(343bp)を標的とする分断ベクターを構築した。デルタ配列内で一ケ所切断される制限酵素XhoIで切断後、形質転換を行った。13個の形質転換体について核型を分析したところ、少なくとも10箇所の異なる部位で分断されていることがわかった。これらの緒果より、デルタ配列は1種の分断ベクターで多数の部位を分断するための標的として有効であることがわかった。次に、分断をさらに効率良く行うため、分断に使用する断片をPCRにより調製できるような分断ベクターを構築した。すなわち、大腸菌ベクターであるpBluescriptSK+を基に、1つのセントロメア、テロメア、及びデルタ配列の左半分をクローンしたベクター(セントロメアカセット)、および1つのテロメア、酵母形質転換体の選択符号、デルタ配列の右半分をクローンしたベクター(選択符号カセット)の2種のベクターを構築した。これらの2種のベクターより、制限酵素切断によりセントロメアカセット、選択符号カセットを調製し、これらを混合して形質転換を行った。10個の形質転換体の核型を、パルスフィールドゲル電気泳動法により分析したところ、5個において複数の部位で分断が起こっている事がわかった。さらに、分断を効率よく行うため、分断に使用する断片をPCRで調製することを試みた。このため、セントロメアカセットの両端に位置するテロメアとデルタ配列にアニールするプライマーペアー、および選択符号カセットの両端のテロメアとデルタ配列にアニールするプライマーペアを設計してPCRを行ったが、増幅断片は得られなかった。そこで、フォワードプライマーとして、テロメアの外側の領域にアニールするプライマーを設計して、PCRを行ったところ、期待される大きさのPCR増幅産物が得られた。これらの増幅断片を用いて、どの程度効率良く分断が起こるを検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Nakagawa, Y. et al.: "O2R a regulatory element mediating Rox-lp-independent O2 and unsaturated fatty acid repressions of OLEl, in Saccharomyces cerevisiae"J.Bacrteriol.. 183. 745-751 (2001)
• [文献書誌] Harashima, S., Kaneko Y.: "Application of the PHO5-gene-fusion technology to molecular genetics and biotechnology of yeast"J.Biosci.Bioeng.. 91. 325-338 (2001)
• [文献書誌] Tamai Y, et al.: "HO gene polymorphism in Saccharomyces industrial yeasts and application of novel HO genes to convert homothallism to heterothallism in combination with the mating-type detcction cassette"Appl Microbiol Biotechnol.. 55. 333-340 (2001)
• [文献書誌] Sakumoto N. et al.: "Dual-specificity protein phosphatase Yvhlp, which is required for vegetative growth and sporulation, interacts with yeast pescadillo homolog in Saccharomyces cerevisiae"Biochem Biophys Res Commun.. 289. 608-615 (2001)
• [文献書誌] Shibasaki S, et al.: "Intelligent yeast strains with the ability to self-monitor the concentrations of intra-and extracellular phosphate or ammonium ion by emission of fluorescence from the cell surface"Appl Microbiol Biotechnol.. 57. 702-707 (2001)