| 研究課題/領域番号 |
12460045
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
松下 一信 山口大学, 農学部, 教授 (50107736)
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| 研究分担者 |
山田 守 山口大学, 農学部, 教授 (30174741)
茂木 立志 東京大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (90219965)
三芳 秀人 京都大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (20190829)
外山 博英 山口大学, 農学部, 助教授 (60240884)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| キーワード | アジドキノン / 光親和性標識 / ユビキノン / 大腸菌グルコース脱水素酵素 / 酢酸菌アルコール脱水素酵素 / バクテリア呼吸鎖 |
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| 研究概要 |
本研究は、大腸菌および酢酸菌呼吸鎖、特に大腸菌のチトクロムbo(Cyo),コハク酸脱水素酵素(SDH)およびグルコース脱水素酵素(GDH)と酢酸菌アルコール脱水素酵素(ADH)、におけるユビキノン結合部位の特定とその酸化還元反応の分子機構を解明することを目指し、これらの酵素の結合型ユビキノンの同定とアジドキノンによる光親和性標識とそれに続くMALDI-TOF-MSによる標識サブユニットさらにはペプチドの解析によってユビキノン結合ドメインの同定を行った。
1)アジド基導入前駆体として2-および3-位に位置特異的にメチル基を有する化合物を合成し、この化合物に対してアジド基の導入を行うことで、2-および3-アジドキノンの合成に成功した。また、これらのアジドキノンは、UV照射によって経時的にアジド基が光分解することも確認した。
2)2種類のアジドユビキノンでの大腸菌Cyoの光親和性標識分析の条件を決定した。
3)GDHのユビキノン反応部位が水溶性のPQQドメインに存在することを膜貫通領域を欠いた変異体酵素を作成し、その精製酵素を用いた反応性の解析より明らかにした。
4)光親和性標識と質量分析により、ユビキノン非結合型として精製されるSDHの膜アンカーサブユニットをキノン酸化還元部位として同定した。
5)GDH, ADHの結合型ユビキノンを解析し、ADHについて、ドデシルマルトサイドで可溶化される時、結合型ユビキノンが認められ、しかもセミキノン型で存在することを明らかにした。
6)ADHのアジドキノンでの標識化条件を決定した。その後、ユビキノン非結合型ADHをアジドキノンで標識し、MALDI-TOF-MS分析を行った。その結果、サブユニットIIが特異的に標識化され、しかもそのユビキノン部位が標識化されること、しかもその結合アジドキノンが電子伝達媒体として働くことも明らかにした。
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