分枝オリゴ糖生成酵素のX線結晶構造解析とタンパク質工学

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12460147
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 坂野 好幸 東京農工大学, 農学部, 教授 (70014959)
• 研究分担者: 酒井 坦 静岡県立大学, 大学院・生活健康科学研究科, 教授 (10092214) ; 殿塚 隆史 東京農工大学, 農学部, 助手 (50285194) ; 神鳥 成弘 東京農工大学, 工学部, 教授 (00262246)
• キーワード: プルラン / サイクロデキストリン / α-アミラーゼ / TVA / イソプルラナーゼ / 結晶構造解析

研究概要

本研究では、好熱性放線菌Thermoactinomyces vulgarisの生産するTVA IおよびTVA II、および黒麹菌Aspergillus nigerの生産するイソプルラナーゼという特徴的な分枝オリゴ糖生成酵素を材料に、遺伝子工学とX線結晶構造解析によって、本年度は以下のように酵素の基質認識機構の一端を明らかにし、また発現ベクターの構築に成功した。
【TVA II触媒残基の改変と基質との複合体との構造解析】TVA IIの触媒残基であるAsp421、Glu354、Asp421を改変した変異酵素を作製した。これらの酵素は野性型のTVA IIに比べ1万分の1程度と非常に弱いながら活性を示し、また、特にAsp421の変異体は他の残基を改変した酵素に比べ反応パターンが異なっていた。さらに、これらの変異酵素を用い、基質であるβ-サイクロデキストリンおよびマルトヘキサオースとの複合体の立体構造解析に成功した。
【TVA Iの結晶構造解析およびドメインNの機能解析】TVA Iの結晶を、ポリエチレングリコールを沈殿剤としたハンギングドロップ蒸気拡散法によって作製した。本結晶をもとに、鉛および白金を用いた多重重原子同型置換法によってTVA Iの立体構造を得ることに成功した。TVA IはTVA IIと同様、ドメインN、A、B、Cという4つのドメインより構成されることが分かった。TVA IIと比較したとき、もっとも異なる構造はドメインNであること、および、TVA IIと異なり結晶中ではモノマーで存在することが明らかとなった。これらは、TVA IとTVA IIの基質特異性の違いの主な理由であると考えられる。
【イソプルラナーゼの発現ベクターの構築】酵母Pichia pastorisによるイソプルラナーゼの発現ベクターを構築した。現在、精製法の検討および部位特異的変異による変異酵素の構築を行っている。

研究成果

• [文献書誌] T.Yokota,T.Tonozuka,Y.Shimura,K.Ichikawa,S.Kamitori and Y.Sakano: "Structures of Thermoactinomyces vulgaris R-47 α-Amylase II complexed with substrate analogues"Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry. 65(3). 619-626 (2001)
• [文献書誌] S.Kondo,A.Ohtaki,T.Tonozuka,Y.Sakano and S.Kamitori: "Studies on the hydrolyzing mechanism for cyclodextrins of Thermoactinomyces vulgaris R-47 α-Amylase II (TVA II)."Journal of Biochemistry. 129(3). 423-428 (2001)
• [文献書誌] T.Yokota,T.Tonozuka,S.Kamitori and Y.Sakano: "The Deletion of Amino-Terminal Domain in Thermoactinomyces vulgaris R-47 α-Amylases"Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry. 65(2). 401-408 (2001)
• [文献書誌] K.Ichikawa,T.Tonozuka,T.Yokota,Y.Shimura and Y.Sakano: "Analysis of Catalytic Residues of Thermoactinomyces vulgaris R-47 α-Amylase II (TVA II) by site-directed mutagenesis "Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry. 64(12). 2692-2695 (2000)
• [文献書誌] A.Padmajanti,T.Tonozuka and Y.Sakano: "Deglycosyl Isopullulanase Retains Enzymatic Activity"Journal of Applied Glycoscience. 47(3&4). 287-292 (2000)
• [文献書誌] 殿塚隆史,坂野好幸,神鳥成弘: "プルランとサイクロデキストリンを分解するα-アミラーゼの機能と立体構造"バイオサイエンスとインダストリー. 58(8). 560-563 (2000)
• [文献書誌] R.Uotsu-Tomita,T.Tonozuka,H.Sakai and Y.Sakano: "Novel glucoamylase-type enzymes from Thermoactinomyces vulgaris and Methanococcus jannaschii whose genes are found in the flanking region of α-amylase genes"Applied Microbiology and Biotechnology. (in press). (2001)