| 研究課題/領域番号 |
12470041
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| 研究機関 | (財)癌研究会 |
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研究代表者 |
中村 卓郎 (財)癌研究会, 癌研究所・発がん研究部, 部長 (00180373)
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| 研究分担者 |
斎木 由利子 (財)癌研究会, 癌研究所・発がん研究部, 研究員 (80311223)
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| キーワード | キメラ型転写因子 / 標的遺伝子 / Ewing肉腫 / 明細胞肉腫 / 転写因子 / EWS-FLI1 / EWS-ATF1 / DIGR法 |
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| 研究概要 |
ヒト軟部肉腫では腫瘍特異的な染色体相互転座のために二つの遺伝子が互いに融合し、キメラ型転写因子が形成される例が多い。このようなキメラ型転写因子の標的遺伝子を包括的に同定しその機能を考察するために、最近開発した蛋白-DNA crosslinking-immunopurification-GFPレポーターアッセイ(DIGR)法を用いて、転写因子が細胞内で結合するDNA配列を直接単離し標的遺伝子を同定した。キメラ型転写因子を発現しているEwing肉腫と明細胞肉腫において、腫瘍細胞をパラフォルムアルデヒドによりクロマチンDNAと核蛋白をクロスリンクし、抗FLI1或いは抗ATF1によりそれぞれEWS-FLI1、EWS-ATF1が結合しているDNA断片を精製した。得られた0.5-2kbのDNA断片がプロモーター或いはエンハンサー領域となるようにgreen fluorescent protein(GFP)を発現するベクターに組み込んでライブラリーを作製した。このライブラリーを転写活性型EWS-FLI1、EWS-ATF1を組み込んだ発現ベクターとともにHeLa細胞に導入した。結合配列をもったクローンの存在するwellではGFPの蛍光を発する細胞が位相差蛍光顕微鏡によって検出できた。陽性クローンを段階的に希釈選択・単離した後、シークエンス解析と必要に応じてゲノムDNAクローンを単離することで複数の標的遺伝子候補を同定した。得られた候補遺伝子の腫瘍細胞における発現、さらにキメラ遺伝子の導入による発現の差をNorthern blotting或いはRT-PCRにより検討している。現在迄に明細胞肉腫において、EWS-ATF1の標的遺伝子としてSH3ドメイン遺伝子POSHを同定し、さらに多くの候補クローンを得、解析を進めている。
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