アデノ随伴ウイルス(AAV)を利用した遺伝子治療テクノロジーの開発研究

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12470203
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 小澤 敬也 自治医科大学, 医学部, 教授 (30137707)
• 研究分担者: 水上 浩明 自治医科大学, 医学部, 助手 (20311938) ; 久米 晃啓 自治医科大学, 医学部, 助教授 (10264293)
• キーワード: 遺伝子治療 / 遺伝子導入 / AAVベクター / パッケージング細胞株 / AAVS1領域 / Rep / ITR / TVI法

研究概要

アデノ随伴ウイルス(AAV)を利用した遺伝子導入法の本格的実用化を目指し、以下の研究を行った。
1.AAVベクター作製法の開発:細胞毒性を有するAAV蛋白質の発現を新しいCre/loxP法で制御することにより、AAVベクター作製用パッケージング細胞株の開発を試みた。特に本研究では、変異loxPを野生型のものと複数組み合わせて用いる複合型Cre/loxP法を応用し、AAV蛋白質のRep、Capの発現を一括制御することを試みた。その結果、10cmディッシュあたり2x10^<10>のベクター産生が観察されたが、今後さらに効率を高める工夫が必要と思われる。
2.AAVベクターで導入した遺伝子の高感度検出法の確立と応用:PCRによる導入遺伝子検出法について条件検討を行った。ITRのD領域に種々のプライマーを設定してlong PCR(必要に応じてnested PCRを追加)を行い、AAVベクターのほぼ全長を検出することが可能かどうか検討した結果、比較的高感度で検出可能なプライマーが見出された。
3.AAVのコンポーネント(ITR配列とRep遺伝子)を利用した第19番染色体部位特異的遺伝子組込み(TVI)法の開発:(1)AAV-ITRの間にマーカー遺伝子の発現ユニットを挟んだプラスミドDNAとRep発現プラスミドベクターを293細胞およびK562細胞にトランスフェクションし、G418耐性となった細胞株を分離した。これらの細胞株を材料として、Alu-PCR法により遺伝子組込み部位近傍の塩基配列を決定した。今回の25クローンの検討では、AAVS1以外の組込み部位に関して、ホモロジー検索で一定の傾向は得られなかった。
(2)組込み活性を保持し、細胞毒性の減弱化した変異Rep発現ベクターについては、スクリーニングを継続中である。

研究成果

• [文献書誌] Kanazawa,T.: "Gamma rays enhance rAAV-mediated transgene expression and cytocidal effect of AAV-HSVtk/ganciclovir on cancer cells."Cancer Gene Ther.. (in press).
• [文献書誌] Shinjyo,T.: "Downregulation of Bim,a proapoptotic relative of Bcl-2, is a pivotal step in cytokine-inititated survival signaling in murine hematopoietic progenitors."Mol.Cell.Biol.. 21. 854-864 (2001)
• [文献書誌] Ozawa,K.: "Gene therapy of Parkinson's disease using adeno-associated virus (AAV) vectors."J.Neural Transm. [suppl]. 58. 181-191 (2000)
• [文献書誌] Maeda,Y.: "Adeno-associated virus-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer into cardiac myocytes."J.Cardiovasc.Pharm.. 36. 438-443 (2000)
• [文献書誌] Urabe,M. : "Self amplification system for recombinant adeno-associated virus production."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 276. 559-563 (2000)
• [文献書誌] Shen,Y.: "Triple transduction with adeno-associated virus vectors expressing tyrosine hydroxylase,aromatic I-amino acid decarboxylase, and GTP cyclohydrolase 1 for gene therapy of Parkinson's disease."Hum.Gene Ther.. 11. 1509-1519 (2000)
• [文献書誌] Shimpo,M.: "Gene transfer into rat renal cells using adeno-associated virus vectors."Am.J.Nephrol.. 20. 242-247 (2000)
• [文献書誌] Shimazaki,K.: "Adeno-associated virus vector-mediated bcl-2 gene transfer into post-ischemic gerbil brain in vivo : prospects for gene therapy of ischemia-induced neuronal death."Gene Ther.. 7. 1244-1249 (2000)
• [文献書誌] Kume,A.: "Long-term tracking of murine hematopoietic cells transduced with a bicistronic retrovirus containign CD24 and EGFP genes."Gene Ther.. 7. 1193-1199 (2000)
• [文献書誌] Matsuda,K.M.: "A novel strategy for the tumor angiogenesis-targeted gene therapy : Generation of angiostatin endogenous plasminogen by protease gene transfer."Cancer Gene Ther.. 7. 589-596 (2000)
• [文献書誌] Muroi,K.: "Autologous periphcral blood stem cell transplantation for adults with B-lineage acute lymphoblastic leukemia : a pilot study."Leukemia Lumphoma. 38. 103-111 (2000)
• [文献書誌] Urabe,M.: "DNA/calcium phosphate precipitates mixed with medium are stable and maintain high transduction efficiency."Anal.Biochem.. 278. 91-92 (2000)
• [文献書誌] Maeda,Y.: "Endogenously generated nitric oxide by nitric-oxide synthase gene transfer inhibits cellular proliferation."J.Phamacol.Exp.Therapeut.. 292. 387-393 (2000)
• [文献書誌] Ozawa,K.: "Progress in Gene Therapy - Basic and Clinical Frontiers."VSP BV, Netherlands (ed. by Bertolotti,R.,Parvez,S.H.,and Nagatsu,T.) . 18 (2000)
• [文献書誌] Hanazono,Y.: "Cell Therapy"Springer-Verlag,Tokyo (ed. by Ikeda,Y.,Hata,J.,Koyasu,S.,Kawakami,Y.,Hattori,Y.). 11 (2000)