自己軟骨細胞を利用したバイオマトリックス膵ランゲルハンス島移植の研究

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12470235
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 剣持 敬 千葉大学, 医学部・附属病院, 講師 (50215133)
• 研究分担者: 西郷 健一 千葉大学, 医学部・附属病院, 助手 (60323424) ; 和田 佑一 千葉大学, 医学部・附属病院, 助手 (10282485) ; 浅野 武秀 千葉大学, 医学部, 講師 (80143311) ; 宮内 英聡 千葉大学, 医学部・附属病院, 医員 ; 松井 芳文 千葉大学, 医学部・附属病院, 医員
• キーワード: 膵島分離 / 軟骨細胞 / 膵島移植 / 遺伝子導入 / 遺伝子銃 / 凍結保存

研究概要

1.軟骨細胞,膵島の混合培養:ハムスターの骨端軟骨を採取,コラゲナーゼ処理にて軟骨細胞を分離,培養した.In vitroでの増殖,重層構造,繊維芽軟骨形成が得られることを確認した.次に,拒絶反応の起こることが確認されているDAラットからLewisラットへの同種移植を想定し,DAラット膵よりコラゲナーゼ消化,Euro-Ficoll比重遠心法にて分離した膵島と,Lewisラットの膝関節よりコラゲナーゼ消化法にて分離した軟骨細胞を混合培養した.膵島形態は保たれ,インスリン分泌も培養後3週間良好に保たれた.
2.Gene Gunを用いた膵島への遺伝子導入:non-viralの遺伝子導入法であるgene gen(Helios^<TM> Gene Gun(BIO-RAD))を用いて,膵島への遺伝子導入につき検討した.Beagle犬より分離した膵島を用い,plasmid pCMS-EGFP(CLONTECH)を導入した.遺伝子発現は蛍光を発する細胞の比率でcountした.1.6μm径の金粒子を200psiの発射圧で施行したときに,約20%の高導入効率が得られた.
3.独自の膵島凍結保存法の開発:独自のバッグ大量凍結保存法を考案した.Beagle犬膵島を骨髄移植に臨床応用されているCP-1液(極東製薬工業)を用いて,バッグ(Cryogenic storage container,CPL99,CharterMed Inc.)に封入し,Program freezer(Cryomed Model 1010)にて緩速凍結した.解凍後の膵島は良好な形態を示し,インスリン分泌能も良好であった(Static incubation:Stimulation Index2.3).

研究成果

• [文献書誌] Kenmochi T: "Improved quality and yield of islets isolated from human pancreala using a two-step digestion method"Pancreas. 20・2. 184-190 (2000)
• [文献書誌] Kenmochi T: "Development of a fully automated islet digestion system."Transplantation Proceedings. 32. 341-343 (2000)
• [文献書誌] Kenmochi T: "Purification of pancreatic islets using hydroxyethyl starch (HES)-Collins solution."Transplantation Proceedings. (in press).
• [文献書誌] Jingu K: "Evaluation of non-heart-beating donors as a potential source for pancreatic islet transplantation."Transplantation Proceedings. (in press).