体外肝組織再構築と組織移植による肝不全治療法の研究

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12470243
• 研究機関: 札幌医科大学
• 研究代表者: 望月 洋一 札幌医科大学, がん研究所, 教授 (40045381)
• 研究分担者: 小島 隆 札幌医科大学, がん研究所, 講師 (30260764) ; 三高 俊広 札幌医科大学, がん研究所, 助教授 (50231618) ; 平田 公一 札幌医科大学, 医学部, 教授 (50136959)
• キーワード: 小型肝細胞 / 増殖 / 成熟化 / 分化 / 移植 / 凍結保存 / 類肝組織 / ミニ肝臓

研究概要

我々は、成熟ラット肝臓より肝幹細胞の一種と考えられる小型肝細胞を分離培養し、成熟肝細胞に分化させ、肝非実質細胞との相互作用により3次元的な立体構造を構築することを見いだした。小型肝細胞はコロニーを作るように増殖し、肝上皮様細胞や星細胞に囲まれるようになるとコロニーの上に盛り上がるように大型の細胞が出現する。そのような立体的構造を呈する部分の細胞は成熟肝細胞に豊富に発現していることが知られている転写因子のHNF4,HNF6,C/EBPαなどを強く発現していることが分かった。2次元的に増殖している小型肝細胞に人為的に基底膜の細胞外基質を多量に含むマトリゲルを薄く載せると3次元的な立体構造を急速に誘導でき、小型肝細胞の成熟化は細胞外基質、特に基底膜成分の一部又は全てがあることが必要で、ラミニンやタイプ4コラーゲンが単独に存在しても成熟化は誘導されない。また、培養一週間ぐらい経った小型肝細胞のコロニーは、コロニーごと分離することが可能で新しいディッシュに再播種すると小型肝細胞は急速に増殖し、1ヶ月ほどでコンフルエントになる。このような小型肝細胞のコロニーを坦体の上で培養し、ある程度増殖させ、組織化させてから生体内に移植する実験を現在行っている。
小型肝細胞を生体内に移植し組織化させる実験を行うためには多量の小型肝細胞を用意する必要がある。一個体から採取可能な小型肝細胞数は限られているため、増殖させた小型肝細胞を保存する方法の確立は必須である。我々は、一年以上凍結保存した小型肝細胞を再び増殖させることに成功した。50%以上の生着率があり、生着すると小型肝細胞は急速に増殖を始め、2週間でコロニーの面積にして約7倍になる。アルブミンの産生も培養経過と共に増える(培養25日で約40μg/ml/48h)。培養を続けるとほぼコンフルエントになる。現在、凍結保存した細胞の移植実験も準備中である。

研究成果

• [文献書誌] 三高俊広: "肝臓における幹細胞システムと肝組織構築"実験医学. 18(4). 431-437 (2000)
• [文献書誌] Mizuguchi T,Mitaka T, et al.: "Paper is compatible bed for rat hepatocytes."Artificial Organs. 24(4). 271-277 (2000)
• [文献書誌] 三高俊広: "肝臓の幹細胞"Molecular Medicine. 38(1). 8-15 (2000)
• [文献書誌] Kojima T,Kokai Y,Mochizuki Y, et al.: "Cx32 but not Cx26 is associated with tight junctions in primary cultures of rat hepatocytes"Experimental Cell Research. 263(2). 193-201 (2001)
• [文献書誌] Mitaka T,: "Hepatic Stem Cells : From Bone Marrow Cells to Hepatocytes."Biochemical Biophysical Research Communication. 281(1). 1-5 (2001)
• [文献書誌] 三高俊広,池田慎一郎,杉本真一: "肝臓の再生."肝胆膵. 42(2). 195-201 (2001)
• [文献書誌] Mitaka T and Sato F.: "The Hepatocyte Review, Chapter 14."Kluwer Academic Publishers (Dordrecht, The Netherlands). 624 (2000)