補助人工心臓離脱に向けた心筋細胞への遺伝子治療

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12470246
• 研究機関: 埼玉医科大学
• 研究代表者: 許 俊鋭 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (30153232)
• 研究分担者: 河本 修身 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (00261967) ; 田辺 大明 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (80281301) ; 五條 理志 埼玉医科大学, 医学部, 助手 (90316745) ; 松田 修 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (00271164)
• キーワード: Antisense / 心不全 / 遺伝子治療

研究概要

前年度の研究では、Phospholambanをターゲットに心不全の分子生物学的アプローチの基礎的な検討を行ってきた。本年度は、Phospholamban antisenseをいかに効率よく心筋細胞に導入し、細胞内の酵素によるOligonucleotideの変性を回避し、その効果を最大限に得ることができるプロトコールの開発を目標に研究を行った。現在まではAntisenseのデザインはS-Oligo型という分子であったが、低い特異性と高い異物性のために臨床応用へと進めたプロトコールはごく僅かであった。そのハードルを克服する為に、1.特異性を高める為に、S-Oligo型ではなくN-Oligo型分子を作成する。
2.ヌクレアーゼの影響を回避する為にアテロコラーゲンを同時投与する。
3.ヌクレアーゼ耐性のMorpholino modified oligonucleotideを使用。
4.Single strand RNAではなくDouble strand RNAを導入することでより高い安定性及び特異性を獲得し得るRNAi(RNA interference)を応用する。
以上の方法を検討した。方法は、マウス胎児心筋細胞培養を行い、Lipofectamineを用いた同一の遺伝子導入プロトコールを用いて上記のantisense oligonucleotideを導入し、Western blottingによりPhospholambanタンパク量の定量化を実施した。いずれの方法も、S-Oligo型分子より有意にタンパク量を減少させていたが、3と4がほぼ同等にタンパクの検出限界にまでPhospholambanを減少させていた。
S-Oligo型分子を用いて、前年度にデザインしたOligonucleotideを心筋症ハムスターの心臓に直接注入することで、Antisense strategyがin vivoにて効果があるかどうかの検討を行った。経胸壁エコーの結果では、一時的には心機能の改善が見られた。今後の課題は、効果の持続の為のプロトコールの作成である。