化学手法による標的分子の迅速同定とリガンド結合部位の高精度解析一般法の確立

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12470483
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 中山 仁 熊本大学, 薬学部, 教授 (70088863)
• 研究分担者: 國安 明彦 熊本大学, 薬学部, 助教授 (90241348) ; 益田 勝吉 サントリー生物有機科学研究所, 研究員 (30190359)
• キーワード: 光アフィニティラベル / 抗リガンド抗体 / TOF-MS / ESI-MS / MS / ラベル化ペプチド断片 / 結合部位の同定

研究概要

薬物や生理活性物質の標的となる高分子の同定と結合構造の詳細を一挙に明らかにできるのは、光アフィニティラベル(PAL)法を用いる化学的手法に限られる。それにもかかわらず、PAL法が、それほど広範には利用されていない最大の理由は、ラベルペプチドの特異的回収とこれを高感度・高精度に検出する分析手法が確立していなかったためである。これをふまえ、本研究では、この手法を普遍化するのに必要な条件を確立し、「高感度・高精度な標的分子の同定およびリガンド結合部位の精密解析の一般法」として提案すること目的としている。研究2年目に当たる本年度に得られた成果は、以下のとおりである。
(1)高い力価をもつハプテン抗体の産生:胆管側膜の薬剤排出ポンプcMOATの基質認識部位構造の解析をめざし、PAL用試薬としてトリフロロメチル-フェニルジアジリン基を含むグルタチオン誘導体1を作製した。また類似構造をもつグルタチオン誘導体をハプテンとして、これを認識する抗体を調製した。この抗体は、1で光ラベルしたラット胆肝膜標品のcMOATを、サプピコモルレベルでも検出できる力価を有していることが確かめられた。
(2)MS/MS分析の高感度化:キャピラリーLCとMS/MSをオンライン化することによって、nanoESI-MS/MSの測定が超微量で行えるようになった。
(3)光ラベルcMOATの断片化条件の確立:1で光ラベルされた部位をMS/MS分析で同定するために必要な、タンパク質の断片化条件、およびハプテン抗体との反応条件がほぼ確立できた。

研究成果

• [文献書誌] K.Kawahara, et al.: "Efficient identification of photolabeled amino acids by immuno-purification and mass spectrometry"Biochem. J.. (in press). (2002)
• [文献書誌] E.Kinoshita, et al.: "Novel wasp foxin diseriminates between neuronal and cardiac sodium channels"Mol. Pharmacol.. 59. 1457-1463 (2001)
• [文献書誌] K.Murata, et al.: "Asymmetric arrangement of auxiliary subunit of skeletal muscle L-tape Ca^<2+> channel"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 282. 284-291 (2001)
• [文献書誌] N.Ohgami, et al.: "CD36 functions as a receptor for advanced glycation end products"Ann. N. Y. Acad. Sci.. 947. 350-355 (2001)
• [文献書誌] K.Kawahara, et al.: "Induction of CHOP and apoptosis by nitric oxide in p53-defecient microgrial cells"FEBS Lett.. 506. 135-139 (2001)
• [文献書誌] K.Kawahara, et al.: "Co-induction of argininosuccinate-synthase, CAT-2, and NOS in activated micrglial cells"Mol. Brain Res.. 90. 165-173 (2001)